脂肪間充質干細胞條件培養基對小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除炎癥反應的影響

焦智慧，馬亞軍，劉笑凝，張千振，王 月，劉 濤，樸晨曦，劉博洋，王洪斌*

(1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.東北林業大學 野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040)

肝是哺乳動物最大的實質器官，具有加工儲存營養物質、代謝藥物毒物、分泌膽汁、合成蛋白質等重要功能。肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是外科手術常見的一種臨床綜合征[1]。20世紀90年代，出現腹腔鏡肝切除術，腹腔鏡技術可以減少腹壁神經和肌肉的損傷，減少出血，加快術后恢復，具有廣闊的發展前景[2]。盡管采用微創外科手術，在肝切除、肝移植等臨床手術中仍不可避免的出現HIRI，嚴重會導致肝炎、肝功能衰竭[3]。而炎癥反應是HIRI重要的病理生理過程[4]，肝缺血再灌注后，引起炎性因子的釋放以及炎癥通路的激活，肝組織微循環紊亂造成細胞損傷，各種炎性因子的聚集導致血供受阻，進一步加重肝細胞的損傷甚至出現局部壞死。目前用于研究HIRI的實驗動物包括小鼠[5]、大鼠[6]、新西蘭大白兔[7]、犬[8]等，這些動物雖易于管理、重復性強，但動物體積、肝解剖結構、新陳代謝和人相差很大，得到的研究結果應用到人類也受到限制[9]，而小型豬與人的同源性相近，研究獲得的數據更有價值，在臨床上易于轉化，是研究HIRI較好的實驗動物選擇[10-11]。

近年來，隨著干細胞治療技術研究的深入，越來越多的研究支持干細胞旁分泌學說是干細胞療效的關鍵機制[12-13]。Lee等[14]首次描述了無細胞療法在臨床前動物模型中對肝疾病的應用，也有研究表明，間充質干細胞條件培養基(mesenchymal stem cells condition medium,MSCs-CM)可以起到優于干細胞本身的治療效果[15]。干細胞受微環境細胞和細胞分泌物的作用，分泌細胞因子、生長因子和趨化因子進入微環境中，并能招募其他干細胞，作用于受損的組織細胞[16]。目前，已有多項研究證明，干細胞的條件培養基在疾病治療方面的療效，包括心肌梗塞[17]、骨關節炎[18]、敗血癥[19]等。所以，本研究旨在通過建立小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除模型，探究脂肪間充質干細胞條件培養基(adipose-derived mesenchymal stem cells condition medium,ADSC-CM)對肝缺血再灌注合并肝部分切除損傷炎癥反應的作用，為比較醫學開展肝病治療，拓寬ADSC-CM移植領域提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

高清內窺鏡攝像系統、內窺鏡冷光源(深圳市神州醫療設備有限公司)，全自動氣腹機、高頻智能電刀、腹腔鏡手術器械(日本Olympus公司)，動物呼吸麻醉機(美國SurgiVet公司)，血細胞分類計數儀(日本光電工業)，酶標儀(美國BIOTEK有限公司)，組織研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)，qRT-PCR儀(瑞士Roche公司)。

硫酸阿托品注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司)，痛立定托芬那酸注射液(巍隆貿易有限公司)，丙泊酚乳狀注射液(西安力邦制藥有限公司)，異氟烷(河北一品制藥有限公司生產)，DMEM低糖培養基(美國Invitrogen有限公司)，胎牛血清(美國CLARK公司)，反轉錄試劑盒(TaKaRa生物技術有限公司)，熒光定量PCR染料(湖南Innovagene科技有限公司)，C反應蛋白(CRP)、透明質酸(HA)、皮質醇(COR)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.2 脂肪間充質干細胞條件培養基的制備

小型豬麻醉后于無菌條件下從腹部獲取脂肪組織，使用無菌的眼科剪將脂肪組織剪碎，加入Ⅰ型膠原酶充分消化后，使用含血清的培養基終止消化，用200目銅網過濾，濾液離心(1 500 r·min-1，10 min)后，棄去上清，用完全培養基(10% FBS，1%青鏈霉素，1%谷氨酰胺)重懸細胞并接種在25 cm2的培養瓶中，于培養箱(37 ℃，50 mL·L-1CO2)中培養。待細胞密度生長至80%時傳代，細胞傳至第4代 進行條件培養基的制備。棄去原培養基，無菌PBS清洗，換用無血清的基礎培養基饑餓培養48 h。收集細胞培養液離心(1 500 r·min-1，10 min)，將上清液用無菌濾器過濾，濾液用3 KD超濾管離心濃縮后，儲存在-80 ℃冰箱，供后續試驗使用。

1.3 實驗動物分組及手術處理

實驗動物為24頭廣西巴馬小型豬，4～6月齡，體重20～25 kg，飼養管理條件在整個試驗過程中保持一致，經臨床整體和一般檢查、各系統檢查和實驗室血液常規檢查無異常后隨機分為4組：模型組(IRI)、DMEM對照組(DMEM)、ADSCs-CM治療組(CM)和ADSCs治療組(ADSCs)，每組6只。小型豬注射硫酸阿托品后，耳緣靜脈注射丙泊酚誘導麻醉，使用異氟烷進行呼吸麻醉，麻醉過程中，異氟烷濃度維持在2.5%～4.0%。4組均通過腹腔鏡技術建立小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除模型[20]，肝右葉持續缺血60 min后再灌注，然后使用高頻電刀離斷肝左葉，將注射的細針經腹腔鏡套管口進入，在距離肝斷端1～2 cm處，4組分別經肝實質注射不同的物質，IRI組：生理鹽水，DMEM組：濃縮的基礎培養基，CM組：濃縮的脂肪間充質干細胞培養基，ADSCs組：脂肪間充質干細胞。其中，ADSCs使用劑量為1×106個細胞·kg-1，ADSCs-CM使用劑量為按照體重計算等量干細胞獲得的條件培養基濃縮液，DMEM和生理鹽水的使用劑量與ADSCs-CM體積相同。術后肌內注射痛立定，并將小型豬放在隔離圈舍單獨護理。試驗流程示意如圖1。

圖1 試驗流程圖Fig.1 Experimental process diagram

1.4 樣本采集與指標檢測

1.4.1 樣本采集 樣本采集分為術前、術后1、3、7 d 4個時間點。血液樣本經小型豬前腔靜脈采集，離心(3 000 r·min-1，10 min)后獲取血清；組織樣本通過腹腔鏡手術采集，樣本均保存在-80 ℃。

1.4.2 肝組織病理結構觀察 將肝組織樣本經4%多聚甲醛固定后，按常規步驟進行石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色后在光學顯微鏡下讀片，觀察肝細胞是否存在變性、壞死，重點觀察炎性細胞浸潤的病理變化。

1.4.3 血液常規指標檢測 使用血細胞計數儀對各組血液樣本進行檢測，包括術前，術后1、3、7 d靜脈血中的白細胞(WBC)、中性粒細胞(NE)、淋巴細胞(LY)。

1.4.4 血清指標ELISA檢測 檢測前從-80 ℃冰箱取出凍存的血清樣本，按照C反應蛋白(CRP)、皮質醇(COR)、透明質酸(HA)試劑盒說明書，使用酶標儀檢測各組不同時間點CRP、COR、HA的表達水平。

1.4.5 肝組織炎癥相關基因水平檢測 使用qRT-PCR檢測肝組織炎癥相關基因在各個時間點表達水平。用Trizol試劑提取總RNA，Prime ScriptTMRT試劑盒反轉錄。引物如表1所示。qRT-PCR反應的體系：2 μL cDNA，0.8 μL上、下游引物，6.4 μL H2O和10 μL Taq SYBR?Green qPCR PreMix。使用Roche 480 qRT-PCR儀檢測，95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s重復40個循環，最后進行融解反應。根據2-ΔΔCt法計算炎癥相關基因IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA相對β-actin的表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR Primers sequences

1.5 數據統計分析

2 結 果

2.1 肝組織病理結構觀察

顯微鏡觀察各組切片，術后1、3 d病理變化明顯，出現較多炎性細胞，結果如圖2所示：術后1 d，IRI組與DMEM組肝組織出現壞死灶，肝細胞索排列結構紊亂，可見大量炎性細胞浸潤，而CM組與ADSCs組的肝細胞腫脹輕微，炎性細胞數量較IRI組與DMEM組少；術后3 d，IRI組與DMEM組仍可見較多的炎性細胞浸潤，而CM組與ADSCs組有少量的炎性細胞，細胞腫脹情況較IRI組與DMEM組輕微，肝小葉結構基本恢復。即肝缺血再灌注合并肝部分切除后，ADSCs與ADSCs-CM移植能減少炎性細胞的浸潤。

黃色箭頭表示炎性細胞；紅色箭頭表示壞死灶Yellow arrows indicate inflammatory cells;red arrows indicate necrotic foci圖2 肝組織病理變化(400×)Fig.2 Pathological changes of liver tissue(400×)

2.2 血液常規指標

結果顯示，WBC、NE、LY在4組都呈現先升高后降低的趨勢。圖3A為WBC結果分析：術后1 d，與IRI組相比，CM組極顯著(P<0.01)、ADSCs組顯著(0.010.05)，且DMEM組與IRI組、CM組與ADSCs組在各個時間點均無顯著性差異(P>0.05)，即CM組與ADSCs組可以降低血液中WBC、NE、LY的升高程度。

各時間點DMEM組、CM組、ADSCs組與IRI組比較，*.0.01

2.3 血清指標ELISA檢測

肝缺血再灌注合并部分切除后，血清中CRP、COR、HA表達如圖4所示。術后1 d，與IRI組相比，CM組、ADSCs組均顯著降低了CRP、COR、HA的表達水平(P<0.01)，CM組與DMEM組具有統計學意義(CRP、HAP<0.01，COR 0.010.05)。DMEM組與IRI組、CM組與ADSCs組在各個時間點均無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 血清指標檢測結果Fig.4 The results of serum parameters

2.4 肝組織炎癥指標

肝組織炎癥相關基因表達水平見圖5所示。圖5A為IL-6 mRNA表達水平：與IRI組相比，CM組和ADSCs組在術后1、3 d極顯著降低IL-6 mRNA水平(P<0.01)；術后1、3 d CM組與DMEM組差異極顯著(P<0.01)。圖5B為IL-1β mRNA表達水平：與IRI組相比，CM組和ADSCs組術后1 d極顯著(P<0.01)、3 d顯著(0.010.05)。即CM組與ADSCs組可以降低術后肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的升高程度，提高IL-10 mRNA的表達。

圖5 炎癥相關基因轉錄水平Fig.5 Transcription levels of inflammation-related genes

3 討 論

肝缺血再灌注損傷涉及多種炎癥因子以及通路，是一個復雜的病理生理過程。肝缺血再灌注后，肝組織微循環紊亂，黏附在肝竇壁的WBC逐漸增多，WBC的聚集和活化導致肝細胞的損傷。缺血早期NE被激活，TNF-α能刺激NE的黏附并外滲，NE的聚集導致血供受阻，進一步加重肝細胞的損傷而致肝局部出現壞死灶。LY通過分泌IL-17促進NE的遷移與黏附來激活補體系統[21]，同時分泌各種可溶性的細胞因子和化學因子，促進炎癥反應發生。這也是肝缺血再灌注后通過病理切片能夠觀察到明顯的炎性細胞浸潤以及局部壞死現象的原因。本研究結果顯示，ADSCs組和CM組減少了炎性細胞的浸潤并降低了WBC、NE、LY的表達，提示ADSCs和ADSC-CM均具有抗炎效果。研究表明，其他MSCs-CM對炎癥反應有明顯的治療作用，Lee等[22]使用人的ADSCs-CM顯著改善了小鼠肝缺血再灌注損傷后的病理組織學評分；Kim等[23]使用扁桃體的MSCs-CM治療四氯化碳(CCl4)誘導小鼠肝損傷，結果證實其治療顯著減少了CCl4損傷小鼠肝的炎癥和肝組織病理損傷。

CRP是第一個被發現的機體急性期反應蛋白，也是公認的炎癥生物標志物。肝缺血再灌注損傷后，肝細胞合成并分泌大量CRP，血液中CRP的濃度幾乎與組織損傷程度成正比，因此，能夠在血清中檢測到大量的CRP[24]。由于肝細胞損傷以及炎癥反應，下丘腦-垂體-腎上腺皮質神經軸系(HPA)紊亂導致血清COR含量上升[25]。肝缺血再灌注會引起肝竇內皮細胞的損傷，肝竇內皮細胞可以通過HA的特異性受體介導內吞作用除去超過90%外周血中HA的含量[26]。因此，可以通過外周血中的HA水平衡量肝損傷肝竇內皮細胞的功能障礙[27]。在本研究中，肝缺血再灌注合并部分肝切除引起IRI組、DMEM組術后血清CRP、COR和HA含量迅速升高，而經過ADSCs和ADSC-CM治療的兩組，有效減緩了CRP和COR的升高程度，抑制HA的升高。在Chen等[28]的研究中，MSCs-CM預處理明顯緩解肝照射后血清HA水平，與本研究結果一致。

肝缺血再灌注可引起各種炎性細胞因子基因的表達，如TNF-α、IL-1β、IL-6等。TNF-α不僅參與炎癥的反應，還參與免疫應答，過量的TNF-α還會和IL-1β激活肝細胞、內皮細胞，誘導大量ROS的產生以及脂質過氧化反應，進而引起肝組織微循環障礙，導致肝細胞的凋亡和壞死。微循環障礙又反過來誘導炎癥的級聯反應，IL-6、IL-8等炎癥介質的釋放擴大了炎癥的效應。因此，促炎因子IL-6在肝缺血再灌注的炎癥反應中較TNF-α和IL-1β晚，但也促進了炎癥反應的發生。IL-10是一種由巨噬細胞產生的能夠拮抗炎癥反應的炎性介質。在正常生理情況下，促炎因子與抑炎因子處于動態平衡，肝缺血再灌注后，引起大量促炎因子分泌激發過度炎癥反應，抑炎因子IL-10含量隨之上升。IL-10能夠抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)，此外，還能增強其他抗炎性因子的釋放，如IL-1受體拮抗劑和溶解性TNF-α受體。已有研究表明，使用骨髓干細胞的條件培養基治療體外輻射誘導大鼠的肝損傷模型，基因檢測結果顯示，條件培養基給藥組顯著降低肝中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平，并增加IL-10 mRNA表達水平[28]。本研究顯示ADSCs組和CM組促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6升高程度受到抑制，而抑炎因子IL-10的升高程度被增強。本研究通過qRT-PCR方法對基因層面進行mRNA的檢測，基因從轉錄到翻譯還有復雜的過程，而ELISA檢測的是翻譯后的蛋白，對mRNA的檢測從炎癥早期證明，ADSC-CM能夠通過抑制促炎癥因子的表達，促進抑炎因子的表達來減輕肝缺血再灌注后的炎癥反應。

本研究中，ADSCs與ADSC-CM作用效果沒有顯著差異，即在不移植干細胞的情況下，移植干細胞的條件培養基可以起到等效的替代作用。目前，干細胞的臨床應用仍面臨諸多挑戰，有研究表明，只有不到3%的間充質干細胞能夠在移植后持續存活2周[29]，且移植后的干細胞仍然存在免疫排斥反應[30]。而無細胞療法從源頭上避免干細胞移植的風險，因此，間充質干細胞條件培養基的研究與臨床應用正逐漸開展。

4 結 論

本試驗探究了ADSCs和ADSC-CM對小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除炎癥反應的療效，發現二者均能夠緩解缺血再灌注造成的病理學損傷，降低血液中炎性細胞數量及肝組織中促炎因子表達，并提高抑炎因子表達，緩解術后炎癥反應。移植ADSC-CM對炎癥反應的作用效果與ADSCs無顯著差異，因此，基于無細胞療法很可能成為未來干細胞移植的替代療法。