腦脊液標志物分析在中樞神經系統白血病中的應用研究進展

王 勉，楊建民，宋志強，唐古生

（海軍軍醫大學第一附屬醫院血液科實驗室，上海 200433）

中樞神經系統白血病（central nervous system leukemia，CNSL）是白血病細胞對中樞神經系統的直接浸潤，中樞神經是白血病髓外受累最常見的部位，有研究發現，約26%的成人初發急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者和21%的初發急性非淋巴細胞白血病患者會表現出中樞神經系統受累[1]。近半個多世紀以來，傳統化療方案的改進和各種靶向藥物的應用，使白血病治療的緩解率得到了顯著提高，但仍有許多白血病患者出現復發，合并CNSL是最重要的原因，預后往往較差[2-3]。初診CNSL患者復發率也較高，約占復發患者的20%～30%，占兒童復發ALL的30%～40%，是復發難治的主要原因[2-3]，CNSL患者需要更強的、靶向中樞的治療措施[2]，早期診斷和治療CNSL，對于預防白血病復發、提高患者生存率具有重要意義。

目前，CNSL的診斷主要依賴于實驗室檢查和/或臨床癥狀。但總體而言，目前的實驗室檢測無法較好地早期診斷CNSL。本文對腦脊液常規檢查（腦脊液壓力、細胞學涂片和生化指標檢測）、流式細胞免疫分型等CNSL實驗室輔助診斷方法和單個蛋白、核酸等標志物，以及各種組學標志的研究進展和臨床應用進行綜述。

1 常規腦脊液細胞學和生化指標檢測

目前，診斷CNSL的金標準是腦脊液細胞形態學檢查，但結果易受樣本采集、制片、主觀判讀等因素影響，靈敏度低，特別是容易漏診細胞較少的樣本，單次腦脊液形態學檢查的敏感性<50%[2]。基于細胞形態學的檢測數據顯示，成人ALL初診時僅有5%～10%伴有中樞神經系統受累[2]，兒童則有8.0%～13.4%[2-4]。10%～35%的腦脊液細胞形態學檢查未查見腫瘤細胞的白血病患者，后續仍會出現中樞神經系統受累[5]。另外，有60%的CNSL患者沒有顱神經麻痹癥狀和細胞形態學表現[6-7]，因此需要更靈敏的方法來確認腦脊液中白血病細胞浸潤情況。腦脊液壓力和生化指標異常，對于臨床癥狀不明顯或處于疾病早期的病例，常會有提示作用。常用指標包括：總蛋白質、糖和氯化物定量。CNSL患者腦脊液蛋白質的含量會明顯增多，主要與病變時血腦屏障通透性發生改變，外周血蛋白質進入腦脊液相關；而糖定量明顯減少是由其分解增多所導致的[8]。但這些指標均不具有特異性，僅能輔助診斷CNSL。

腦脊液乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）也常被臨床用來輔助判斷CNSL。正常情況下，腦脊液LDH活性很低，約為血清中的 1/10，發生CNSL時，白血病細胞浸潤到腦膜和腦實質，使腦脊液LDH活性升高，與其他方式聯用可提高CNSL的診斷率[9]。正常腦脊液中的β2-MG含量很少，CNSL時白血病細胞無限增殖，腫瘤抗原致敏淋巴細胞、單核細胞，使其大量合成β2-MG。王文靜等[10]發現，CNSL患者腦脊液中β2-MG水平明顯高于非CNSL患者，單指標陽性預測值和陰性預測值分別為70.76%和68.01%，敏感性和特異性分別為67.34%和72.34%。因此，白血病患者腦脊液β2-MG水平升高可提示中樞神經系統腫瘤浸潤可能。然而，腦脊液常規、LDH和β2-MG等指標的檢測結果受炎癥、感染、出血等多種因素的影響，臨床上也常見腦脊液壓力和/或蛋白升高或生化指標異常，但疾病進程中始終未見CNSL臨床表現的患者。因此，腦脊液常規生化指標檢測診斷CNSL的特異性、敏感性仍遠不能滿足需求。

2 腦脊液多參數流式細胞（multi-parameter flow cytometry，MFC）免疫分型

腦脊液MFC免疫分型較細胞形態學檢查具有分析速度快、收集細胞數量多和敏感性高（>0.01%）、特異性好等優點[3，5]，可以更加敏感地預測CNSL的發生[11]，是目前臨床診斷CNSL的重要方法，極大提高了CNSL的確診率[12]。

對于檢測CNSL患者腦脊液白血病細胞免疫表型的抗體組合策略，目前國內外尚無統一的標準。通常是各實驗室根據不同類型CNSL患者白血病細胞初發免疫表型（leukemia-associated immunophenotype，LAIP）輔以正常發育分化過程中特異性的系列標志，依據實驗室流式細胞儀多色通道的數量，組成各實驗室特定的多色抗體組合。基本的判斷方法是觀察腦脊液有核細胞中是否有LAIP，或者表型特點不同于正常分化發育過程中各系列細胞（different from normal，DFN）的異常細胞。由于腦脊液細胞數少，通常僅組成單管或2管多色抗體組合，常用的抗體可參考《多參數流式細胞術檢測急性白血病及漿細胞腫瘤微小殘留病中國專家共識（2017版）》[13]。HEGDE等[5]采用MFC在51例侵襲性淋巴瘤患者腦脊液中檢出11例（22%）陽性，而細胞形態學檢查僅檢出1例陽性。最新數據表明，采用MFC和/或細胞形態學方法檢測腦脊液診斷初診成人ALL伴CNSL陽性率可達25%，兒童初診時伴CNSL陽性率為29.0%～34.5%，遠高于單用細胞形態學方法[2，14]，MFC聯合細胞形態學檢查腦脊液，可明顯提高CNSL的診斷率[15]。與細胞形態學檢查陽性的患者相比，細胞形態學檢查陰性但MFC陽性患者腦脊液細胞計數和腫瘤細胞百分比較低，且大多患者無癥狀[16]。我們在臨床工作中采用MFC技術也多次先于臨床和細胞形態學檢查發現白血病/淋巴瘤細胞中樞浸潤。流式細胞術高度敏感，能夠在細胞計數非常低的樣本中準確檢出惡性腫瘤細胞，進而較早地發現中樞神經系統浸潤，提示臨床進行早期干預。但是，MFC方法學對技術人員血液病理論知識、實驗操作及數據分析、樣本的即時性等要求比較高。因為中樞浸潤腫瘤細胞的免疫表型可能發生改變，引起MFC的漏檢，所以當MFC陰性而細胞形態學檢查陽性時，并不能排除CNSL，需要臨床醫生和檢測人員綜合評估、仔細評判。

3 蛋白質水平的標志物

在疾病發展過程中，白血病細胞向腦組織遷移并與血腦屏障結合，通過分泌多種細胞因子、生長因子和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）破壞細胞外基質和管腔緊密連接蛋白，從而破壞血腦屏障，并協助形成致瘤的局部微環境[17]。在這一過程中，各種蛋白均可能在腦脊液中出現，并可作為潛在的CNSL的標志物。

MMP是細胞外微環境主要的調節因子，與基底膜破壞有關，與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）共同促進血管生成和腫瘤細胞轉移[18]。在惡性膠質瘤中，腦脊液MMP-9可能是早期檢測腫瘤進展的標志，在血液系統中發揮重要作用的是MMP-2和MMP-9，主要降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原蛋白[19]。有學者比較了67例白血病患者（CNSL患者29例）腦脊液中的MMP表達水平，發現CNSL患者MMP-2水平明顯高于非CNSL患者和對照者，后兩者之間差異無統計學意義，提示MMP-2可能有助于診斷CNSL[20]。原發性中樞神經系統淋巴瘤和非中樞神經系統淋巴瘤細胞分泌型磷酸化糖蛋白1（secreted phosphorylated glycoprotein-1，SPP-1）存在差異表達[21]，急性B淋巴（母）細胞白血病（B-acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者復發時腦脊液細胞中SPP-1蛋白表達水平比初診時顯著升高[22]，提示腦脊液SPP-1或許可以作為預測CNSL的潛在靶標。

腦脊液中VEGF與受體結合，可促進血管生成、增加血管通透性、破壞血腦屏障，進而促進腫瘤細胞的生長與轉移。與非CNSL患者相比，伴CNSL的ALL患者腦脊液中VEGF水平明顯升高[23]。與血清樣本相比，腦脊液樣本中的細胞因子和趨化因子可更好地反映CNSL的狀態[10]。ROBERTS等[24]發現，趨化因子配體-2（chemokine ligand-2 ，CCL2）具有破壞血腦屏障的作用，有利于白血病細胞進入中樞神經系統，引起中樞神經系統浸潤，無論是腦脊液中，還是外周血中，CNSL患者的CCL2均高于非CNSL患者和對照者。CCL2增加與腫瘤中樞神經系統轉移相關，可能是CNSL的發生機制之一[25]。ALL患者腦脊液中的可溶性白細胞介素-2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL2-R）水平對白血病細胞的識別能力優于腦脊液白細胞計數，腦脊液sIL2-R臨界值為10 U/mL時，診斷敏感性為89.5%，特異性為89.6%，可作為中樞神經系統受累的客觀指標。腦脊液sIL2-R水平或可作為診斷CNSL新的輔助指標[26]。

總體而言，關于以上單一蛋白類標志物對CNSL的診斷和預測作用，無論是特異性，還是敏感性，目前國內外的相關研究仍缺乏實質性的進展，它們在臨床實踐中的價值仍不清楚，尚需要大樣本數據對相關指標單用或聯用的診斷效能進行更多的臨床評價。

4 腦脊液核酸檢測

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者FLT3通常高表達，可能與存在FLT3內部串聯重復基因（internal tandem duplication of the FLT3，FLT3-ITD）、FLT3/D835Mt突變或者混合譜系白血病串聯重復基因（tandem duplication of the mixed lineage leukemia gene，MLL-TD）相關，ALL患者也存在不同程度的FLT3表達[27-28]。OZEKI等[27]發現，CNSL患者腦脊液FLT3 mRNA陽性率及表達水平顯著高于完全緩解組和對照組非腫瘤患者，非CNSL患者腦脊液中FLT3基因表達多為陰性。腦脊液FLT3陽性組單個核細胞數高于陰性組，LDH水平也更高，提示腦脊液FLT3表達與CNSL發生密切相關[28]。腦脊液WT1 mRNA水平與CNSL以及血液學復發也有很強的相關性[29]。盡管不能覆蓋所有CNSL患者，但腦脊液中FLT3和WT1表達水平的改變或可作為CNSL更敏感的早期診斷和療效判斷指標。同時采用MFC和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測疾病特異性的免疫球蛋白重連基因IGHR重排和/或T細胞受體基因TCR重排評估ALL患兒腦脊液白血病浸潤情況，并與傳統的細胞形態學檢查進行比較，發現PCR檢測基因重排診斷CNSL的陽性率可達60%，MFC檢測的陽性率為46.6% ，細胞形態學檢查的陽性率僅為22.2%，MFC和PCR診斷效能是細胞形態學檢查的2～3倍，提示腦脊液疾病特異性基因重排核酸檢測可作為ALL患者早期中樞浸潤敏感的診斷方法。然而，基因重排檢測需要設計個性化疾病特異性的PCR引物，耗時且檢測成本高，也需要足夠量的腦脊液和白血病細胞，技術要求高，而且較容易出現假陰性結果，因而臨床易見MFC陽性但PCR不能檢出的情況，需要綜合判斷[30-31]，因此該技術臨床應用尚不廣泛。

游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是存在于血液、尿液、腦脊液等體液中的細胞外DNA。正常情況下，腦脊液cfDNA水平較低，中樞浸潤白血病/淋巴瘤患者腦脊液中可檢出腫瘤特異性的DNA——循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及其相關突變，輔助CNSL的診斷，可以彌補細胞形態學檢查和MFC免疫分型的不足。約85%的初發中樞神經系統淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）患者攜帶MYD88（L265P）突變。數字PCR檢測腦脊液細胞DNA或cfDNA MYD88（L265P）突變診斷CNSL有極高的特異性[32]。有研究對中樞淋巴瘤組織靶向下一代測序（next generation sequencing，NGS），對獲得的突變位點，在外周血和腦脊液中采用數字PCR進行個體化突變位點檢測，發現腦脊液cfDNA檢出率及突變頻率比血漿更高，且腦脊液檢測cfDNA與MFC免疫分型結果吻合度好[33]。對腦脊液行全外顯子測序，進一步證實了腦脊液ctDNA診斷中樞神經系統淋巴瘤的高特異性，在系統性非中樞淋巴瘤患者腦脊液中均未檢測到ctDNA，且CNSL患者治療后，腦脊液MFC檢測陰性的患者，部分仍可檢出ctDNA[34]。

因此，基于普通PCR對腦脊液浸潤細胞DNA和/或RNA，以及cfDNA中腫瘤特異性突變位點進行數字PCR或NGS檢測，可能是敏感性更高的原發或繼發中樞神經系統淋巴瘤檢測方法。

5 組學檢測

ROY等[35]采用基于液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的方法，在中樞神經系統B細胞淋巴瘤與其他良性疾病患者的腦脊液中差異定量和鑒定了500種蛋白質，將兩者進行了有效區分。GUO等[36]使用LC-MS/MS對比ALL患兒和對照者的腦脊液，鑒定出51種差異表達蛋白質，并發現這些差異表達蛋白質并不是隨機的，相互之間有復雜的互動網絡，其中多種蛋白質都與癌癥有關，提示白血病細胞相關蛋白可以出現在腦脊液中。MO等[37]采用LCMS/MS對6例ALL伴CNSL患兒治療前后的腦脊液進行蛋白質組學分析，并繪制了CNSL患兒腦脊液的蛋白質組學圖譜，量化了化療前后發生變化的蛋白質，證實這些蛋白質可作為ALL疾病進展標志物以及CNSL新的治療靶點。然而，上述研究[35-37]樣本量均較小，觀察周期相對較短，需要擴大樣本量，并延長觀察時間，進一步驗證這些改變的蛋白質在CNSL診斷中的作用。

代謝組學主要通過色譜、質譜與核磁共振技術，以及幾種技術的聯合使用，定性或定量分析內源性小分子代謝物，繼而快速、系統、全面地檢測各種因素導致的細胞生理或病理性代謝物變化，為疾病的早期診斷與預后監測提供強有力的支持。目前，對血液病患者腦脊液代謝組學的研究較少。對腦原發或繼發中樞淋巴瘤、肺癌腦轉移或未轉移患者的腦脊液進行代謝組學的研究發現，腦實體瘤患者與非腦實體瘤患者腦脊液在多種氨基酸和嘌呤代謝通路上存在顯著差異[38]。腦原發中樞淋巴瘤和肺癌腦轉移均存在植物鞘氨醇和L-谷氨酰胺水平的上調。植物鞘氨醇水平升高可能反映了相對較高的腫瘤細胞增殖速率和脂質膜增加重塑；L-谷氨酰胺增高可能與腦腫瘤快速增長所需的高能耗相關[39]。與腦原發中樞淋巴瘤患者相比，繼發中樞淋巴瘤患者腦脊液中5-氨基咪唑上調，但肌醇磷酸、高半胱氨酸和戊基蛋氨酸下調，可以反映出2種疾病之間固有的病理生理差異，或可用于2種疾病的鑒別診斷[40]。有研究發現，采用8個代謝產物的組合，可以鑒別診斷肺癌腦轉移與非腦轉移，曲線下面積為0.91；6個代謝物鑒別診斷繼發中樞淋巴瘤與腦轉移的曲線下面積為0.87；提示代謝組學可區分不同腦腫瘤患者腦脊液的代謝物差異，初步顯示出其診斷不同類型腦腫瘤的巨大潛力[40]。本課題組正在進行的研究結果顯示，腦脊液代謝組學檢測可以有效輔助區分ALL患者中樞浸潤情況，且其確診CNSL的時間可能更短（數據尚未發表），提示采用腦脊液代謝組學進行CNSL的診斷和鑒別診斷，具有明確的臨床可操作性和實際的臨床價值，值得進一步擴大樣本量進行臨床研究和推廣應用。對相關特異性代謝產物的進一步回溯分析，有助于從代謝角度理解腫瘤中樞浸潤可能的新機制。

6 總結

血液系統惡性腫瘤中樞神經系統受累患者臨床預后較差。腦脊液腫瘤細胞形態學篩查和MFC檢測是目前診斷CNSL的主要方法，但其敏感性、特異性尚不能滿足臨床需求。蛋白標志物、核酸分析，各種組學評估臨床研究的開展有望在腦脊液樣本中發現新的CNSL標志物，并可能更早提示CNSL的發生，但仍然需要更多的臨床研究數據支持。未來研究不僅要著眼于發現新的和更敏感、更特異的腦脊液分析方法和新的標志物，還要通過多中心的大樣本臨床試驗來驗證已經發現的標志物、代謝物的臨床實用性。