甜櫻桃“三早二選一促”高效育種方法

吳雅琴，程和禾，陳 龍，李玉生，高 倩，郭 勇，吳永杰，趙艷華

（河北省農林科學院昌黎果樹研究所 河北 昌黎 066600）

甜櫻桃具有結果早，見效快、綠色安全等優點，近年來發展勢頭迅猛，栽培面積達23.33 萬hm2以上，單位面積產值遠遠高于其它樹種，已成為新的經濟增長點，也是農民增收的重要樹種。但在甜櫻桃產業快速發展的過程中，一些制約產業發展的瓶頸問題也暴露無遺，如主栽品種單一、缺少不同熟期的優良品種，導致成熟期過于集中，果品供應周期短；良種化程度低，果個小、裂果重、單產低的品種仍占較大比例；優良品種奇缺，具有自主知識產權的品種非常少，引進品種存在種植區域和管理技術方面“水土不服”的問題，造成了種植戶的高投入，低回報，未能發揮甜櫻桃“小水果（面積小），高效益（價格高）”的優勢；優良新品種培育難度越來越大，必須尋求育種技術的創新與突破；為促進甜櫻桃產業健康長遠發展，滿足旅游觀光、采摘的需求，全面提升甜櫻桃產業的市場競爭力，培育優質甜櫻桃新品種勢在必行。利用傳統育種方法培育新品種需要20~30 年，育種周期長，因此，開展甜櫻桃高效育種技術研究，建立現代高效育種技術，培育具有自主知識產權的突破性甜櫻桃品種，對提升櫻桃產業市場競爭力，促進櫻桃產業健康可持續發展具有重要意義。

河北省農林科學院昌黎果樹研究所櫻桃與生物技術研究室從2000 年開始進行甜櫻桃新品種培育技術研究，建立了甜櫻桃“三早二選一促”的高效育種方法，其中“三早”即早獲得雜交苗的方法（甜櫻桃胚搶救技術體系建立，甜櫻桃體細胞胚發生技術體系建立和甜櫻桃快速播種當年成苗技術建立）；“二選”即利用自交親和性狀分子標記輔助篩選技術和質構分析篩選技術盡快篩選出優質并符合育種目標的雜交后代；“一促”即利用砧木、整形修剪、促控藥劑等縮短甜櫻桃實生苗童期技術。將育種周期縮減了3~5 年，大大提高了育種效率，并利用該方法培育出了7 個甜櫻桃新品種。

1 “三早”——三種雜交（實生）苗早獲得的3 種方法

1.1 甜櫻桃胚搶救技術體系建立 以紅燈與斯特拉的雜交胚為試材，研究了甜櫻桃幼胚的最佳搶救時期是在30 d 以后進行，并篩選出適宜的胚萌發培養基、新梢增殖培養基、生根培養基[1]。

建立了甜櫻桃胚搶救技術程序：取花后30~45 d果實種子→砸破外種皮→酒精浸泡30 s→無菌水沖洗2 次→0.1%升汞消毒7 min→去內種皮→84 消毒液浸泡20 min→接種，胚萌發培養基（MS+0.4 mg/L IAA+1.0 mg/L BA）→植株形成→繼代，新梢增殖培養基（MS + 0.4 mg/L IAA +0.7 mg/L BA→生根（1/2MS +0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L IBA）→馴化移栽。

最佳馴化移栽方法為將生根苗移至溫室后，先遮蔭，再逐漸增加光強，30 d后，開口煉苗7 d再移栽，此時生根苗葉片濃綠，肥厚，苗粗壯，莖呈紅褐色，半木質，主根為淺紅色，有白色側根，移栽成活率達95%。

1.2 甜櫻桃體細胞胚發生技術體系建立 以甜櫻桃‘紅燈’ב斯特拉’，未成熟幼胚子葉為試材，研究了胚性愈傷組織的誘導及繼代培養、體細胞胚發生及植株再生等培養條件[2]。研究了不同基因型體細胞胚胎發生的差異：對花后30~45 d 的紅燈、紅艷、先鋒、拉賓斯、短枝斯特拉、斯特拉、短枝斯特拉×紅燈共7 個不同基因型幼胚進行體細胞胚發生誘導，誘導成功率分別為90.5%、72.5%、59.5%、53.8%、59.5%、29.8%、27.4%。從以上數據看，不同基因型間的體細胞胚誘導存在很大差異，其中紅燈和紅艷兩個早熟基因型的誘導率較高。

建立了甜櫻桃體細胞胚發生技術程序：取雜種幼胚→0.1%升汞消毒7 min→去內種皮接種→84 液消毒20 min→去胚芽→愈傷組織誘導（MS+2.0 mg/L 2,4-D +1.0 mg/L BA +40 g/L 蔗糖+5.0 g/L 瓊脂）→體細胞胚誘導（MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L BA+40 g/L蔗糖+5.5 g/L 瓊脂）→胚體成熟及植株再生（1.0 mg/L 6-BA+MS+0.1 mg/L NAA）→繼代培養（0.5 mg/L 6-BA+MS+0.2 mg/L NAA）→生根（1/2MS+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L IBA）→馴化移栽。

1.3 甜櫻桃快速播種當年成苗技術建立 開展了從選種、種子預處理、種子液體培養、播種到出苗的適宜條件篩選，研究建立了甜櫻桃快速播種當年成苗技術程序：3 月下旬，選擇溫室剛成熟的自然授粉甜櫻桃品種‘早大果’，‘紅燈’、‘玲瓏脆’和‘甜心’等，取無病蟲害的果實，將果肉與種子剝離，裝入干凈的燒杯，用自來水洗凈，去除漂浮在水面上的種子（敗育），將沉在水底的種子取出，砸破外種皮，取出種仁（保證種仁完整），將其放在三角瓶中，用蒸餾水沖洗干凈，并用蒸餾水浸泡，蓋上封口膜，置于2~6 ℃冰箱冷藏1~2 d，取出浸泡后的種仁置于培養皿中，用手術刀片去除內種皮，放入盛液體培養基（不含瓊脂的MS，1.0 mg/L BA、0.2 mg/L IAA）的三角瓶中進行培養，封口并置于4 ℃冰箱冷藏，3 d 換1 次培養液，培養6 d 后播種；5~7 d 后，陸續有芽露出土面，待植株長到10~15 cm，5 月中下旬將培養成株的實生苗定植田間，10 月可長成0.8~1.0 m 的成苗。次年進入選種圃，進行選種。

利用這3 種方法提早、高效獲得雜交（實生）后代，從而縮短育種周期。

2 “二選”——兩種雜交（實生）后代篩選技術

2.1 自交親和性狀分子標記輔助篩選技術 研究了CTAB法提取甜櫻桃總DNA的方法[3]：取嫩葉2~3 片，液氮研磨后轉入2 mL 離心管中，加入0.9 mL 2%CTAB 提取緩沖液（5 mol/L NaCl，0.25 mol/L EDTA，1 mol/L Tris-HCl pH8.0，2%PVP 和0.1%DIECA），置于65 ℃保溫30 min，冷卻至室溫，加入等體積CI（chloroform∶octanol=24∶1)，12 000 rpm 16 ℃離心15 min，取上清，加入等體積CI 洗滌離心2 次，2/3 體積異丙醇沉淀，棄上清，乙醇清洗晾干，加入200L TE（pH8.0）緩沖液溶解。

引物BFP200/ BFP201 與內對照引物PCR IC-F/IC-R 的反應體系為15L：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTPs，2 mmol/L MgCl2，0.2mol/L 引物BFP200/ BFP201，0.1mol/L引物IC-F/IC-R，1.5 UTaq DNA 聚合酶，約20 ng DNA模板。PCR 反應條件：94 ℃3 min，94 ℃45 s，50 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環，72 ℃延伸10 min；PCR 體系2 反應條件:94 ℃3 min，94 ℃45 s，50 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環，72 ℃延伸10 min。PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠(含0.5g/mL EB)上進行電泳分離，電泳緩沖液為0.5×TBE，5 V/cm 電壓電泳40~60 min，紫外燈下成像并拍照。

篩選程序為：甜櫻桃實生苗嫩葉→提取總DNA→PCR→2%瓊脂糖凝膠→自交親和性狀確定→田間套袋自花結實率驗證。

利用該方法可在苗期對雜交后代是否具備自交親和性狀進行鑒定，有利于自花結實后代的早期篩選，提高育種效率。

2.2 質構分析快速篩選技術 質地特性是櫻桃果實極其重要的品質因素，物性分析儀所反映的主要是與力學特性有關的果蔬質地特性，具有較高的靈敏性與客觀性。主要測試果實的成熟度、堅實度、果肉硬度、果實的脆性及果皮或果肉的彈性等。TPA 測試法是通過探頭的二次下壓全面的反映水果的硬度、脆性、彈性、內聚性、回復性、咀嚼性等。經過反復測試及調整優化，篩選出了適于甜櫻桃的參數設置：探頭P50，模式為TPA，測試前、測試及測后速率均為1 mm/s，壓縮程度25%，停留間隔為2 s，觸發力為0.1 N。

利用該技術可快速準確測定果實硬度，進行硬肉、耐貯品種篩選。

3 “一促”——雜交（實生）后代縮短童期、促早開花技術

在櫻桃新品種培育過程中，實生苗從種植到開花、結果一般需要3~4 年時間，嚴重影響育種進度。我們在生產實踐中總結出一套利用噴施促控藥劑，結合刻芽、掐尖、扭稍等栽培管理措施，促使縮短實生苗童期，第2 年就可以開花、結果，有利于優系的早期篩選，可以縮短育種周期2~3 年。

4 總結

利用甜櫻桃“三早二選一促”的高效育種方法，克服了傳統育種方法中育種周期長、育種效率低的問題。通過早期篩選技術，將不符合育種目標的單株盡早淘汰，結合促早結果技術，縮短實生苗童期技術，縮短育種周期，提高育種效率和準確率。利用該方法已培育出‘玲瓏脆’、‘五月紅’、‘早蜜露’、‘昌華紫玉’、‘昌華紫脆’、‘昌華紫霞’和‘晚蜜露’共7 個甜櫻桃新品種。