鹿茸多糖對MC3T3-E1成骨細胞與BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與分化的作用研究

【摘 要】 目的：研究鹿茸多糖對MC3T3-E1成骨細胞與BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與分化的影響。方法：用最佳起效濃度的鹿茸多糖提取液培養(yǎng)兩種細胞24 h、48 h、72 h后，用CCK-8檢測細胞的增殖活性，采用ELISA法檢測細胞內(nèi)ALP蛋白酶活性。結(jié)果：與空白對照相比，以鹿茸多糖提取液培養(yǎng)兩種細胞24 h、48 h、72 h后，細胞活性均明顯提高;培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞24 h后，細胞內(nèi)ALP蛋白酶活性增高，具有顯著性差異。結(jié)論：鹿茸多糖提取液能夠通過促進成骨細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，以及上調(diào)成骨細胞內(nèi)ALP蛋白酶活性等環(huán)節(jié)起到抗骨質(zhì)疏松作用。

【關(guān)鍵詞】 鹿茸多糖;MC3T3-E1成骨細胞;BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞;細胞增殖;細胞分化

【中圖分類號】R932"" 【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2022）10-0010-05

The Effect of Antler Polysaccharide on the Proliferation and Differentiation of MC3T3-E1

Osteoblasts and BMSCs Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

ZHANG Bo FENG Tianpu LIU Yuanyuan*

Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China

Abstract：

Objective To study the effect of antler polysaccharide on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts and BMSCs bone marrow mesenchymal stem cells.Method After cultivating two kinds of cells with the optimal concentration of velvet antler polysaccharide extract for 24 h， 48 h， 72 h，Use CCK-8 to detect cell proliferation activity， ELISA method was used to detect the ALP protease activity in the cells. Results Compared with the blank control group， after culturing the two kinds of cells with velvet antler polysaccharide extract for 24 h， 48 h， 72 h， the cell viability was significantly improved， and there was a very significant difference. After culturing MC3T3-E1 osteoblasts for 24 hours， the ALP protease activity in the cells increased， with significant differences. Conclution Antler polysaccharide extract can play an anti-osteoporosis effect by promoting the proliferation of osteoblasts and bone marrow mesenchymal stem cells， and up-regulating the ALP protease activity in osteoblasts.

Key words：velvet Antler Polysaccharide;MC3T3-E1 Osteoblast;BMSCs Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells ;Cell Proliferation;Cell Differentiation

骨質(zhì)疏松為中老年人群常見慢性病，尤其是中老年女性骨質(zhì)疏松癥更為普遍，患病后容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性疼痛，極大地增加了骨折的風險，嚴重影響中老年人群的生活質(zhì)量。目前治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物有抗骨代謝類藥物，如雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙磷酸鹽類、降鈣素類等;促骨合成類藥物，如甲狀旁腺激素類藥物[1-2]。這些藥物雖然有一定療效，但是也存在著副作用的風險，如：雌激素與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌之間的關(guān)系仍然存在著爭議;結(jié)合型雌激素會明顯升高HDL膽固醇水平;雙膦酸鹽類藥物容易產(chǎn)生頜骨壞死、肌肉骨骼痛、食道癌、腎功能衰竭不良反應(yīng)等。有研究[3-4]表明，中藥在提高骨密度、緩解骨質(zhì)疏松性疼痛等方面具有顯著作用，并且具有副作用小、適合長期服用等優(yōu)勢，因此，醫(yī)藥學(xué)界近年來對中藥治療骨質(zhì)疏松癥的研究尤為重視。

鹿茸作為中藥使用歷史悠久，《中國藥典》記載鹿茸具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任，托瘡毒等功效。現(xiàn)代藥理研究[5]發(fā)現(xiàn)鹿茸具有恢復(fù)心肌功能、調(diào)節(jié)免疫、促進性功能、抗疲勞、防治骨質(zhì)疏松等多種活性。有研究[6]表明，鹿茸藥材中的多糖成分具有改善骨質(zhì)疏松癥狀的作用，因此，本文以鹿茸中的多糖成分為研究對象，探討鹿茸多糖對MC3T3-E1成骨細胞以及BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與分化的影響，為進一步闡明鹿茸抗骨質(zhì)疏松癥的有效成分和作用機制提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 酶標儀（Bio-TeK，美國）;CKX41SF倒置顯微鏡（ OLYMPU S，日本）;MCO-15AC型CO 2培養(yǎng)箱（SANYO，日本）;800離心機（江蘇金壇市城西曉陽電子儀器廠）;101-（1）型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海路達實驗儀器有限公司）;MDF-192型超低溫冰箱（Sanyo，日本）;優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)（中國）;24 孔、96 孔培養(yǎng)板（greiner，德國）;15 mL 離心管（greiner，德國）;移液器（Select BioProducts，美國）;MLS-3780 高壓滅菌器（SANYO，日本）。

1.2 細胞 小鼠MC3T3-E1成骨細胞、大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞均購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試藥 MEMα（含核苷）培養(yǎng)基、原代間充質(zhì)細胞培養(yǎng)體系購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司;胎牛血清FBS購于clark;青霉素、鏈霉素購于大連美侖生物技術(shù)有限公司;PBS 平衡鹽溶液購于武漢博士德生物工程有限公司;0.25%胰蛋白酶購于Gibco公司;CCK-8購于美國APExBIO生物科技有限公司;小鼠堿性磷酸酶（ALP）ELISA試劑盒、大鼠堿性磷酸酶（ALP）ELISA試劑盒均購于武漢博士康生物工程有限公司。

1.4 鹿茸多糖提取液的制備 鹿茸藥材粉碎，過80目篩，加10倍量石油醚（60～90 ℃）脫脂2次，殘渣加30倍量水，80 ℃回流提取兩次，濾過，合并濾液，將濾液濃縮至適量，加乙醇調(diào)至含醇量為70%，靜置12 h，分取沉淀物，用乙醇洗滌2次，蒸干，精密稱取干燥提取物適量，加水溶解，使成濃度為30 mg/mL，無菌條件下以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2 實驗方法

2.1 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細胞的影響

2.1.1 鹿茸多糖最佳起效量的確定 將生長狀態(tài)良好的小鼠MC3T3-E1成骨細胞制備成單細胞懸液，以4×104個/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL。實驗分為6組，分別為給藥組1、2、3、4、5與空白對照組，每組設(shè)8個復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入不同量多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度分別為0.05 μg/μL、0.3 μg/μL、0.6 μg/μL、0.9 μg/μL、1.2 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基。藥物干預(yù)24 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度（OD）值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理。

2.1.2 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響[7-10] 將生長狀態(tài)良好的小鼠MC3T3-E1成骨細胞制備成單細胞懸液，以4×104個/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL，共接種3板。實驗分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)8個復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度為0.9 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基，分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度（OD）值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理。

2.1.3 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細胞分化的影響[11-12] 將生長狀態(tài)良好的小鼠MC3T3-E1成骨細胞制備成單細胞懸液，以5×104個/mL的濃度接種于24孔板上，每孔500 μL，共接種3板。實驗分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)4個復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入鹿茸多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度為0.9 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基。分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，棄去培養(yǎng)液，收集細胞，采用ELISA法對細胞內(nèi)ALP蛋白酶活性進行檢測，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理。

2.2 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞的影響

2.2.1 鹿茸多糖最佳起效量的確定 將生長狀態(tài)良好的大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞制備成單細胞懸液，以5×104個/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL。實驗分為6組，分別為給藥組1、2、3、4、5與空白對照組，每組設(shè)8個復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入不同量的多糖提取液，再加入適量的培養(yǎng)基，使終濃度分別為0.3 μg/μL、0.6 μg/μL、0.9 μg/μL、1.2 μg/μL、1.8 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基。藥物干預(yù)24 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度（OD）值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理。

2.2.2 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響 將生長狀態(tài)良好的大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞制備成單細胞懸液，以5×104個/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL，實驗分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)8個復(fù)孔，共接種3板。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入多糖提取液，再加入適量的培養(yǎng)基，使終濃度為1.2 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基，分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度（OD）值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理。

2.2.3 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響[13-15] 將生長狀態(tài)良好的BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞制備成單細胞懸液，以6×104個/mL的濃度接種于24孔板上，每孔500 μL，共接種3板，實驗分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)4個復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度為1.2 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基，每3天換一次液，分別于藥物干預(yù)5 d、10 d、15 d后，棄去培養(yǎng)液，收集細胞，采用ELISA法對細胞內(nèi)ALP蛋白酶活性進行檢測，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理。

3 實驗結(jié)果

3.1 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細胞作用的最佳起效量確定 以鹿茸多糖提取液對小鼠MC3T3-E1成骨細胞干預(yù)24 h后，細胞的活性隨著藥物濃度的增加而明顯增強，并且與空白對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在每孔加藥量達到0.9 μg/μL后，其增殖作用趨于穩(wěn)定，因此確定最佳起效量為0.9 μg/μL。結(jié)果見表1。[KH*2]

3.2 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響 小鼠MC3T3-E1成骨細胞經(jīng)鹿茸多糖提取液干預(yù)增殖24 h、48 h、72 h后，細胞活性隨著藥物作用時間的增加逐漸增強，并且不同時間點給藥組與空白對照組相比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

3.3 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細胞分化的影響 以鹿茸多糖提取液干預(yù)作用小鼠MC3T3-E1成骨細胞24 h后，ALP蛋白酶活性顯著增強，并且與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），作用48 h、72 h后ALP蛋白酶活性有所增強，但與空白組比較沒有顯著性差異。結(jié)果見表3。

3.4 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞作用的最佳起效量確定 以鹿茸多糖提取液干預(yù)大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞24 h后，細胞的活性隨著藥物濃度的增加而明顯增強，并且與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在每孔加藥量達到1.2 μg/μL后增殖作用不再顯著增強，確定最佳起效量為1.2 μg/μL。結(jié)果見表4。

3.5 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響 鹿茸多糖提取液干預(yù)大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞增殖24 h、48 h、72 h后，細胞活性增強作用逐漸減弱，但均強于空白對照組，并且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表5。

3.6 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響 以鹿茸多糖提取液干預(yù)大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞5 d和15 d后，細胞內(nèi)ALP蛋白酶活性有所增加，但與空白對照組沒有顯著性差異。結(jié)果見表6。

4 討論

成骨細胞是骨形成的基本功能單位，骨髓間充質(zhì)干細胞具有多向分化性的特點，在一定誘導(dǎo)條件下可以向成骨細胞分化。對成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)是探索骨質(zhì)疏松癥機制的重要模型[16-17]。實驗結(jié)果表明，以鹿茸多糖提取液作用于成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞24 h、48 h、72 h后，以CCK-8法檢測細胞活力，均高于空白對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明鹿茸多糖能夠促進成骨細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖。

堿性磷酸酶（ALP）廣泛分布于人體組織和體液，其大部分由骨細胞產(chǎn)生，是成骨細胞成熟的特異性標志，因此檢測堿性磷酸酶的活性對成骨研究具有重要意義[18]。實驗結(jié)果顯示，鹿茸多糖提取液干預(yù)小鼠MC3T3-E1成骨細胞24 h后，ALP蛋白酶活性增強，且與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明鹿茸多糖能夠促進小鼠MC3T3-E1成骨細胞的成熟。以鹿茸多糖提取液干預(yù)作用大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞5 d、15 d后，ALP蛋白酶活性均有所增加，但與空白對照組比較沒有顯著性差異。由此可見，鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細胞具有增強分化的趨向，這對于促進骨生成具有積極意義。

綜上所述，鹿茸多糖是鹿茸具有抗骨質(zhì)疏松作用的潛在有效物質(zhì)之一，能夠作用于成骨細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和分化等環(huán)節(jié)，這可能是鹿茸起到促進骨生成、抗骨質(zhì)疏松作用機制之一。

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（收稿日期：2021-10-11 編輯：劉 斌）

基金項目：錦州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（2019007）。

作者簡介：張博（1998-），男，漢族，本科，研究方向為中藥分析。E-mail：1332776301@qq.com

通信作者：劉元媛（1980-），女，碩士，講師，研究方向為中藥分析。E-mail：liuyuanyuan5237@163.com