重度子癇前期患者血清和胎盤組織中ADMA與DDAH2的表達水平及其相關性

王 宇, 周杜娟, 黃 艷, 徐 雁, 夏宏林

(安徽醫科大學附屬宿州醫院， 安徽 宿州 234000)

子癇前期是指孕婦在妊娠20周后發生的血清蛋白、血壓以及血脂的異常情況，其發病率高達6%～8%，隨著病情進展會累及到腦、心、肝和腎等多個重要臟器官，形成重度子癇前期[1]，不僅會使得母嬰面臨嚴峻的挑戰與威脅，而且影響妊娠結局。既往研究發現，重度子癇前期是炎癥免疫過度激活、氧化應激以及遺傳等多種因素共同作用的結果[2]，早發型重度子癇前期發病早、病情危重，直接威脅母嬰健康，其會通過重塑胎盤血管誘發胎源性疾病，表現為一氧化氮(nitric oxide，NO)表達異常及活性降低，從而引起母胎血管內皮受損[3]；晚發型則程度輕，多由機體與疾病耐受失衡有關。近年來，研究發現非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)以及甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginie dimethylaminohydrolase，DDAH)能夠調節機體NO，該機制主要是通過影響酶活性實現的，進而導致血管內皮激活，在損傷形成中有一定的參與作用[4]。本研究以2017年1月至2020年10月62例重度子癇前期患者作為研究對象，分析血清和胎盤組織ADMA與DDAH2在重度子癇前期中的表達及其相關性，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:前瞻性收集安徽醫科大學附屬宿州醫院收治的重度子癇前期患者病例，來源時間范圍為2017年1月至2020年10月，病例總數為62例，其中早發型重度子癇前期患者(早發型重度子癇前期組)32例，晚發型重度子癇前期患者(晚發型重度子癇前期組)30例。早發型重度子癇前期患者年齡(22～37)歲，平均年齡(29.63±4.02)歲；孕周(25～35)周，平均孕(32.39±1.14)周。晚發型重度子癇前期患者年齡21～38歲，平均年齡(29.53±4.09)歲；孕(26～36)周，平均孕(34.95±1.21)周。選擇同期健康孕婦(n=30)作為對照組，年齡36～23歲，平均年齡(29.18±4.21)歲，孕(25～36)周，平均孕(33.84±1.64)周。三組孕婦年齡及孕周對比，無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入與排除標準:入組標準：①收集對象均為初產婦，且B超顯示為單胎;②重度子癇前期診斷標準參照《妊娠期高血壓和子癇前期指南2019版》[5]；③患者及家屬已明確研究目標及流程，自愿參與研究并在知情同意書簽字，醫學倫理委員會掌握研究相關事項，并批準;④產婦年齡≥18歲，可正常交流。排除標準：①合并精神異常、心理障礙或意識喪失患者；②合并原發性高血壓、糖尿病及心腦血管疾病患者；③聽力喪失、語言溝通不順暢，對研究無法做到順利配合患者。

1.3方 法

1.3.1血清胎盤樣本采集:血液樣本采集均應在清晨空腹狀態下進行，抽血部位為肘部，抽血量以6mL為宜，放置于室溫環境下靜置30min，然后置于4℃環境下，按照2500r/min的離心速率實施離心處理，離心半徑設置為22.5cm，離心處理時間為15min，將血清分離，保存于-70℃冰箱中。產婦娩出胎盤后立即將臍帶位置血管密集部位胎盤組織，以1.5cm×1.0cm×0.5cm為宜，需要注意避開鈣化點位置。采用生理鹽水進行反復沖洗，并采用濾紙做吸干處理，在液氮下進行短暫冷凍，然后保存于-70℃冰箱環境中待測。

1.3.2血清ADMA與DDAH2檢測:嚴格按照ELISA試劑盒說明檢測ADMA及DDAH2指標，試劑盒由泉州市睿信生物科技有限公司提供。完成標準品稀釋、加樣以及溫育等操作，并進行洗滌、加酶以及顯色處理，然后完成測定。

1.3.3胎盤組織ADMA及DDAH2表達檢測:分別提取三組研究對象胎盤標本，處理步驟包埋-切片-脫蠟，然后實施抗原修復，將山羊血清封閉液及第一抗體適量加入，漂洗后將生物素化二抗及鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)試劑依次加入其中。實施DAB顯色及蘇木精復染處理。陽性：染色后細胞核呈現顏色為棕黃色。陰性：未著色或僅呈現背景顏色。Fromowitz綜合計分法：0分：陽性細胞數量低于1%；1分：陽性細胞數量在1%～25%之間；2分：陽性細胞數量介于25%～50%；3分：陽性細胞數超過50%；染色強弱評分依據：0分表示未染色；1分為淡黃色；2分為黃色；3分棕黃色；兩項評分進行綜合處理相乘，共分為陰性(-)、弱陽(+)、陽性(++)以及強陽(+++)4個級別，對應分值分別為0分、1～3分、4～6分、9分。

1.4觀察內容:①比較三組研究對象的外周血清ADMA及DDAH2水平；②比較三組研究對象的外周血清ADMA及DDAH2的陽性表達率；③分析血清中ADMA與DDAH2表達的相關性。

2 結 果

2.1三組研究對象外周血清ADMA及DDAH2水平比較:與對照組相比，晚發型及早發型重度子癇前期組ADMA均較高，DDAH2均較低，差異有統計學意義(P<0.05)，晚發型與早發型重度子癇前期組患者相比，后者ADMA較前者高，DDAH2水平后者較前者低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2三組研究對象胎盤組織ADMA和DDAH2表達率比較:三組ADMA陽性表達率比較，差異有統計學意義(χ2=16.389，P=0.000)；三組DDAH2陽性表達率比較，差異有統計學意義(χ2=12.370，P=0.000)；早發型重度子癇前期組胎盤組織ADMA陽性表達率(93.75%)高于晚發型重度子癇前期組(66.67%)及對照組(46.67%)，其陽性表達率經Fisher的精確檢驗后，差異有統計學意義(P=0.010，0.000)。早發型重度子癇前期胎盤組織DDAH2陽性表達率(37.50%)低于晚發型重度子癇前期(66.67%)及對照組(80.00%)，其陽性表達率經Fisher的精確檢驗后，差異有統計學意義(P=0.025，0.001)。見表2。

表1 三組研究對象外周血清ADMA及DDAH2水平比較

表2 三組研究對象胎盤組織ADMA和DDAH2表達率比較

2.3血清中ADMA及DDAH2表達相關性分析:血清ADMA水平與DDAH2在早發型及晚發型重度子癇前期均呈現為負相關(r=-0.71，-0.77，P<0.05)。

3 討 論

作為產科常見并發癥，子癇主要指的是不明病因的抽搐，表現為全身小動脈痙攣以及全身器官及臟器血液灌流的減少[6]。既往研究發現，子癇前期與多基因有著密不可分的聯系，多基因遺傳會加重對子癇前期的易感性，引起胎母免疫平衡及耐受失調，降低免疫抑制反應，引起胎盤缺氧、缺血，損傷血管內皮，進而形成子癇前期[7]。早發型重度子癇前期伴隨明顯胎盤組織凋亡，阻斷滋養細胞進入，各類因子進入母體循環系統后會使得NO減少，難以發揮對血壓的調節作用，考慮有明顯內皮損傷。

作為一種天然氨基酸，ADMA主要來源于人體組織、體液及細胞，能夠對一氧化氮合酶活性產生競爭性抑制，使得NO合成受到一定的抑制，這也是血管內皮損傷的主要因素，進而影響到血流動力學,以往有學者在研究中發現少部分ADMA會經過腎臟被排出，90%會受到DDAH的水解作用以瓜氨酸及二甲胺形式被排出[8]。DDAH1主要來源于胰腺、主動脈及中性粒細胞，其中肝、腎部位置表達最高。處于妊娠期女性DDAH2主要存在心臟及胎盤組織中。當孕婦處于病理狀態，DDAH會減少，導致ADMA在機體大量聚集，降低eNOS活性[9]。以往有學者在動物試驗中發現ADMA處于異常狀態下，會影響到子癇前期患者胎盤功能，主要表現為血管異常收縮[10];ADMA持續升高，長此以往會使得血管內皮功能受到不同程度損傷，增加高血壓發生風險。本研究就不同組別孕婦進行了血清ADMA水平檢測，從研究得出的數據可以看出早發型重度子癇有著更高的水平，且陽性表達率在三組中居于首位，三組差異顯著，考慮與以下幾個因素有關：①過度ADMA表達減少內源性NO的生成，降低了eNOS對血管內皮及血管舒張功能的保護作用;②ADMA能夠對SOD、CAT等抗氧化物質分泌產生抑制作用，使得胎盤組織中滋養細胞被炎癥介質破壞，對凋亡程度產生激活作用，滋養細胞凋亡速度明顯增加，這也是子癇前期形成的重要機制；可以將該指標作為評估胎盤功能的可靠指標。作為一種胞質蛋白酶，DDAH2能夠將90%以上ADMA降解，妊娠期孕婦心血管及胎盤組織是DDAH2的主要分布部位，既往有學者在研究中發現DDAH2在高血壓及高血脂中呈現出低轉錄及低表達[11]。本研究早發型重度子癇前期組血清DDAH2水平及胎盤組織DDAH2陽性表達率均較晚發型及對照組低，差異有統計學意義(P<0.05)，說明DDAH2在早發型重度子癇前期呈現出明顯下調。早發型重度子癇前期DDAH2與ADMA能夠對ERKl/2-CREB信號通路產生影響，競爭內皮細胞氧化氮合酶，使其表達下調及降低一氧化氮生成，加重胎盤血管內皮細胞損傷及提高全身微小血管的緊張性，可見胎盤組織中DDAH2與ADMA相關性與血清中兩者表達是相通的，因此僅對血清中DDAH2與ADMA表達相關性進行分析，Pearson相關系數分析顯示，血清ADMA水平與DDAH2在早發型及晚發型重度子癇前期均呈現為負相關(r=-0.71，-0.77，P<0.05)；提示早發型重度子癇前期的形成與上述兩項指標有著一定的關聯性，但由于樣本少、精力有限，結果可能存在一定的偏倚，有待進一步大樣本、大規模研究，為臨床提供更多可靠的依據。

綜上所述，與正常孕婦及晚發型子癇前期孕婦相比，早發型重度子癇前期患者ADMA有明顯升高趨勢，DDAH2表現為明顯降低，血清ADMA和DDAH2表達水平可作為診斷、評估早發型重度子癇前期的可靠指標，為治療方案提供可靠的依據。