華蟾素逆轉(zhuǎn)白細(xì)胞介素-17A引起的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥

朱園 劉秀丹 朱志剛 李康保 鐘偉杰

廣州市第一人民醫(yī)院1老年病科血液腫瘤科，2超聲醫(yī)學(xué)科，3老年病科消化科（廣州 510180）

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤亞型，約占25%～35%［1］，在我國(guó)占比更高，可達(dá)45%［2］。雖然一線(xiàn)的免疫化療R-CHOP方案改善了DLBCL患者的預(yù)后，但仍有相當(dāng)一部分患者因利妥昔單抗耐藥而出現(xiàn)進(jìn)展或復(fù)發(fā)，有研究報(bào)道［3］，30%的DLBCL病例對(duì)利妥昔單抗耐藥，既往對(duì)利妥昔單抗治療敏感的B細(xì)胞淋巴瘤病人再次接受治療時(shí)，接近60%的病例出現(xiàn)利妥昔單抗耐藥［4］。

腫瘤微環(huán)境中包含有輔助性17細(xì)胞（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），Th17細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素（IL）-17起作用。新的CD4+T細(xì)胞亞型IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞（IFT）為T(mén)reg和Th17細(xì)胞分化的中間階段細(xì)胞，也可以分泌IL-17。研究發(fā)現(xiàn)［5-6］IFT促進(jìn)食管癌和結(jié)腸癌生長(zhǎng)。IL-17是DLBCL發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素，并與預(yù)后相關(guān)。IL-17在體內(nèi)及體外均促進(jìn)DLBCL的生長(zhǎng)［7］。利妥昔單抗使DLBCL細(xì)胞分泌IL-6增加，促進(jìn)Th17和IFT細(xì)胞表達(dá)增加并分泌IL-17增加，抑制了p53的表達(dá)，誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞抵抗利妥昔單抗［8］。

華蟾素（cinobufagin）的主要成分是干蟾皮提取物，所含的蟾蜍苷元及華蟾蜍精具有較強(qiáng)的抗癌作用［9］。華蟾素可增強(qiáng)惡性淋巴瘤的化療效果［10］。華蟾素可抑制消化道腫瘤患者Treg細(xì)胞的數(shù)量［11］，降低肺癌患者外周血中IL-17等Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)［12］。華蟾素還可調(diào)控肺癌患者Th17和Treg細(xì)胞及IL-17的表達(dá)［9］。上述研究均局限于外周血，而目前尚無(wú)華蟾素對(duì)DLBCL腫瘤微環(huán)境中Th17和Treg細(xì)胞的研究。

本研究通過(guò)體外細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建模擬的DLBCL腫瘤微環(huán)境，通過(guò)ELISA、qRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞凋亡檢測(cè)等方法，探討華蟾素能否改善IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥，并初步分析其中的機(jī)制。本研究首次在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)華蟾素能逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞 CCK-8試劑盒購(gòu)買(mǎi)自日本Dojindo公司，Transwell小室購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)CORNING公司，重組人IL-17A購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)R&D Systems公司，利妥昔單抗（rituximab，0.1 g/100 mL）購(gòu)買(mǎi)自瑞士諾華公司，華蟾素（5 mL/支）購(gòu)買(mǎi)自安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司。所有ELISA試劑盒、流式抗體和凋亡試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)eBioscience公司，western blot抗體均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Santa Cruz公司。人體外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）是通過(guò)空腹抽取健康志愿者的外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque方法分離獲得。人DLBCL細(xì)胞株SU-DHL-2（ABC型）和SU-DHL-4細(xì)胞株（GCB型）購(gòu)買(mǎi)自BNCC（北京，中國(guó)）。本研究方案獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理批件號(hào)為K-2019-034-01。

1.2 體外細(xì)胞共培養(yǎng) 本項(xiàng)目包含兩個(gè)體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分別培養(yǎng)72 h。SU-DHL-2/4細(xì)胞和PBMCs的細(xì)胞濃度均為1×106個(gè)/孔，IL-17A濃度為0.1 ng/mL，利妥昔單抗?jié)舛葹?0 μg/mL，華蟾素用量為注射液原液0.2 mL。分組具體如下：實(shí)驗(yàn)一：分成2大組，各6小組，分組如下：SU-DHL-2單獨(dú)；SU-DHL-2+華蟾素；SU-DHL-2+利妥昔單抗；SU-DHL-2+利妥昔單抗+華蟾素；SU-DHL-2+利妥昔單抗+IL-17A；SU-DHL-2+利妥昔單抗+IL-17A+華蟾素；SU-DHL-4單獨(dú)；SU-DHL-4+華蟾素；SU-DHL-4+利妥昔單抗；SU-DHL-4+利妥昔單抗+華蟾素；SU-DHL-4+利妥昔單抗+IL-17A；SU-DHL-4+利妥昔單抗+IL-17A+華蟾素。實(shí)驗(yàn)二：將SU-DHL-2/4細(xì)胞、PBMCs按1∶1的比例共培養(yǎng)，并使用Transwell小室間接培養(yǎng)，加或不加華蟾素，其中SUDHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞置于小室中，其他細(xì)胞置于小室外。分組如下：PBMCs+SU-DHL-2；PBMCs+SU-DHL-2+華蟾素；PBMCs+SU-DHL-4；PBMCs+SUDHL-4+華蟾素。

1.3 Western blot 本研究使用western blot檢測(cè)各組SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞中cleaved PARP、cleaved caspase-3和GAPDH蛋白的表達(dá)，步驟與方法同文獻(xiàn)［13］。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。Th17細(xì)胞檢測(cè)：在37℃和5%CO2條件下，在培養(yǎng)基中加入50 ng/mL的佛波酯、10 μg/mL的Brefeldin A和1 μg/mL的離子霉素，刺激細(xì)胞5 h。然后用抗CD3-FITC、抗CD8-PE和抗IL-17A-APC抗體在室溫下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色1 h。Treg細(xì)胞檢測(cè)：在室溫下用抗CD25-PE-Cy7、抗CD4-FITC、抗Foxp3-PE和IL-17A-APC抗體進(jìn)行染色1 h。然后上機(jī)分析，使用Flowjo 10軟件分析數(shù)據(jù)。CD3+CD8-IL-17A+細(xì)胞定義為T(mén)h17細(xì)胞，CD4+CD25+Foxp3+IL-17A+細(xì)胞定義為IFT細(xì)胞。

1.5 CCK-8、ELISA和細(xì)胞凋亡測(cè)定 步驟與方法同文獻(xiàn)［13］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Two-tailed independent-sample Student′s t/t檢驗(yàn)對(duì)兩組之間進(jìn)行比較。單因素方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)（每?jī)山M之間）用于多組之間的比較。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥 前期已經(jīng)證實(shí)IL-17A可引起DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥［8］，本研究旨在探索華蟾素能否逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的耐藥。見(jiàn)圖1，華蟾素并不能直接抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞的增殖（SU-DHL-2：P ＞ 0.99；SU-DHL-4：P ＞0.99）；利妥昔單抗可顯著抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞的增殖（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；而IL-17A明顯減弱了利妥昔單抗抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞增殖的作用，引起耐藥（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；最后，華蟾素逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞對(duì)利妥昔單抗的耐藥（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）。

圖1 華蟾素逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥Fig.1 Cinobufagin reversed the rituximab resistance of DLBCL cell lines induced by IL-17A

2.2 華蟾素逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株凋亡率減少 為了進(jìn)一步探討華蟾素逆轉(zhuǎn)IL-17A引起DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗耐藥的機(jī)制，筆者檢測(cè)了華蟾素對(duì)DLBCL細(xì)胞株凋亡的影響。圖2A為不同分組中SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞的具有代表性的凋亡流式圖。如圖2B-C所示，利妥昔單抗顯著增加了SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞的凋亡率（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；而IL-17A加入后，顯著抑制了利妥昔單抗誘發(fā)的SUDHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞的凋亡率（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；而華蟾素又逆轉(zhuǎn)了IL-17A這一作用，增加了SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞的凋亡率（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）。這些結(jié)果表明華蟾素是通過(guò)增加DLBCL細(xì)胞株的凋亡來(lái)改善IL-17A引起的對(duì)利妥昔單抗的耐藥。

圖2 華蟾素逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株凋亡率減少Fig.2 Cinobufagin reversed the reduced apoptosis rate of DLBCL cell lines induced by IL-17A

2.3 華蟾素通過(guò)升高Cleaved PARP和Cleaved caspase-3的表達(dá)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞株的凋亡 進(jìn)一步檢測(cè)華蟾素對(duì)DLBCL細(xì)胞株中常見(jiàn)凋亡信號(hào)通路中的常見(jiàn)蛋白的影響。收集各組中的SUDHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞，使用Western blot法檢測(cè)cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平。圖3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，華蟾素組輕微升高了DLBCL細(xì)胞株內(nèi)cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平，且華蟾素+IL-17A+利妥昔單抗組比IL-17A+利妥昔單抗組DLBCL細(xì)胞株內(nèi)的cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高。這些結(jié)果提示，華蟾素可能通過(guò)升高cleaved PARP和cleaved caspase-3表達(dá)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞株的凋亡。

圖3 華蟾素通過(guò)升高SU-DHL-2和SU-DHL-4細(xì)胞中cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達(dá)Fig.3 Cinobufagin increased the expressions of cleaved PARP and cleaved caspase-3 in SU-DHL-2 and SU-DHL-4 cells

2.4 華蟾素抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細(xì)胞的分化，降低IL-17A水平 除了直接影響DLBCL細(xì)胞株的凋亡以外，還進(jìn)一步研究華蟾素對(duì)腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細(xì)胞的分化及IL-17A水平的影響。見(jiàn)圖4B、D，華蟾素顯著抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞微環(huán)境中 Th17（SU-DHL-2：P=0.011；SU-DHL-4：P=0.025）和IFT細(xì)胞（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P=0.017）的分化。而且，華蟾素也顯著減低SU-DHL-2或SU-DHL-4細(xì)胞微環(huán)境中IL-17A的水平（SU-DHL-2：P＜0.01；SUDHL-4：P＜0.01）（圖4E），但對(duì)TGF-β和IL-10水平無(wú)影響（圖4F-G）。

圖4 華蟾素抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細(xì)胞的分化，降低IL-17A水平Fig.4 Cinobufagin inhibited the differentiation of Th17 and IFT cells in tumor microenvironment，and then decreased the level of IL-17A

3 討論

初治DLBCL患者中有約40%最終會(huì)復(fù)發(fā)或進(jìn)展，這些患者的3年無(wú)疾病進(jìn)展生存率僅為37%，總生存率僅為49%，預(yù)后非常差，而獲得性的利妥昔單抗耐藥是其中的重要原因［14］。因此，探索并闡明利妥昔單抗耐藥的機(jī)制以及找到逆轉(zhuǎn)利妥昔單抗耐藥的藥物非常重要。導(dǎo)致利妥昔單抗耐藥的原因很多，主要包括以下三方面：CD20結(jié)構(gòu)功能異常、補(bǔ)體和抗凋亡蛋白異常表達(dá)抑制利妥昔單抗作用和腫瘤微環(huán)境的改變等［15］。前期研究［8，16］證實(shí)利妥昔單抗可促進(jìn)DLBCL腫瘤微環(huán)境中IL-17A水平升高，IL-17A導(dǎo)致DLBCL細(xì)胞株凋亡減少，引起利妥昔單抗耐藥。

本研究結(jié)果證實(shí)，外源性IL-17A在體外可構(gòu)建DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥模型，而華蟾素通過(guò)：（1）升高cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達(dá)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞株的凋亡；（2）抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細(xì)胞的分化降低IL-17A水平這兩方面作用，最終逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥。

IL-17A是IL-17家族6個(gè)成員（IL-17A-F）中之一，主要來(lái)源于Th17細(xì)胞，部分來(lái)源于IFT細(xì)胞，IL-17A是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要成分之一［17］。IFT細(xì)胞是Treg和Th17細(xì)胞之間的一種中間形態(tài)，早已被證實(shí)能分泌IL-17A［18］。IL-17A已被多項(xiàng)研究證實(shí)能促進(jìn)卵巢癌、結(jié)腸癌等腫瘤的化療或靶向藥物耐藥［19-20］。而且，前期研究［8，16］已經(jīng)證實(shí)IL-17A可引起DLBCL對(duì)利妥昔單抗的耐藥。本研究中通過(guò)外源性IL-17A順利構(gòu)建DLBCL細(xì)胞株對(duì)利妥昔單抗的耐藥模型，與之前的研究結(jié)論一致。因此，如何能降低腫瘤微環(huán)境中IL-17A水平或拮抗IL-17A作用成為改善DLBCL對(duì)利妥昔單抗耐藥的關(guān)鍵因素。

華蟾素是我國(guó)中藥瑰寶之一，是我國(guó)蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍的全皮陰干后，經(jīng)提取加工處理，制成的水溶性成分，主要成分包括蟾毒內(nèi)酯類(lèi)、吲哚生物堿類(lèi)、多肽、膽固醇等［21］。華蟾素已被廣泛應(yīng)用于肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中，均取得明顯抑瘤作用［22］。相比于西醫(yī)藥物，華蟾素優(yōu)勢(shì)在于其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、放化療增敏及逆轉(zhuǎn)耐藥等作用［22］。LIU等［23］發(fā)現(xiàn)華蟾素能逆轉(zhuǎn)鼻咽癌對(duì)順鉑藥物化療的耐藥性，王玲等［24］也發(fā)現(xiàn)華蟾素能逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥。而且，華蟾素能降低肺癌患者外周血中IL-17等Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)［12］，可調(diào)控肺癌患者Th17和Treg細(xì)胞及IL-17的表達(dá)［9］。cleaved PARP和cleaved caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中的兩種重要蛋白，這兩者水平升高，提示細(xì)胞凋亡率增高［25］。ZHANG等［26］研究發(fā)現(xiàn)華蟾素能升高cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)而促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡。與上述前期研究一致，本研究體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)華蟾素升高cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達(dá)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞株的凋亡，抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細(xì)胞的分化降低IL-17A水平，最終逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL對(duì)利妥昔單抗的耐藥。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了華蟾素在逆轉(zhuǎn)化療耐藥上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究證實(shí)華蟾素在體外升高cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達(dá)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞株的凋亡，抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細(xì)胞的分化降低IL-17A水平，最終逆轉(zhuǎn)IL-17A引起的DLBCL對(duì)利妥昔單抗的耐藥。未來(lái)希望能進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者人體試驗(yàn)中證實(shí)華蟾素逆轉(zhuǎn)利妥昔單抗耐藥的作用，為未來(lái)臨床上應(yīng)用華蟾素聯(lián)合傳統(tǒng)免疫化療藥物治療DLBCL患者提供更充實(shí)的證據(jù)。華蟾素未來(lái)有望成為DLBCL治療的聯(lián)合用藥之一。