電針對帕金森模型小鼠GLP-1R介導的PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的調控作用

李含章 祁羚 張小蕾 陳祥林 郭磊 郭淑琴 馬駿

湖北中醫藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協同創新中心（武漢 430060）

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一種好發于中老年人的慢性進行性中樞神經系統疾病，PD發病主要表現為靜止性震顫、肌強直、體位障礙等運動功能障礙［1］。目前，醫學界對于PD的發病原因和機制尚未完全闡明。研究［2］發現，胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是機體胃腸道L細胞釋放的一種胃腸道激素，可穿過血-腦脊液屏障，通過與胰高血糖素樣肽1受體（glucagonlike peptide-1 receptor，GLP-1R）結合發揮多種生物效應，在PD、阿爾茨海默病、外周神經病變、腦卒中等疾病中具有一定的神經保護作用。由此可見，GLR-1R信號通路在PD發生、發展過程中介導了重要的調節機制，為治療PD提供了潛在的治療靶點。前期研究［3-6］已證實，針刺能夠通過釋放興奮性氨基酸、抑制氧化應激反應、調控泛素一蛋白酶體系統、促進線粒體功能恢復等機制改善行為學癥狀，發揮神經保護作用，但電針通過GLP-1R介導的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinosiyol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）信號通路改善PD運動功能障礙的研究報道相對較少。本研究擬從黑質（substantia nigra，SN）GLP-1R介導的PI3K/AKT/GSK-3β信號通路角度，探討電針對PD小鼠的作用機制，為臨床應用電針治療帕金森提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 本研究采用48只SPF級C57/BL6雄性小鼠（7～8周齡，由湖北省實驗動物研究中心購進，動物許可證編號：SYXK（鄂）2017-0067），喂養于標準動物房，室溫22～25℃，濕度45%～55%，小鼠可自由攝食和飲水，適應性喂養1周，按隨機數字表法分為正常組（normal control group，NC）、模型組（model group，M）、電針組（electroacupuncture group，EA）、抑制劑組（DPP-inhibitor group，DI），每組12只。

1.2 主要試劑與儀器 魚藤酮、羧甲基纖維素、DPP-4抑制劑利格列汀（阿拉丁試劑有限公司），TH（博士德生物工程有限公司），兔多抗p-PI3K、p-GSK-3β、小鼠單抗GSK-3β（abcam公司），兔多抗PI3K、p-AKT、AKT（江蘇親科生物研究中心有限公司），兔單抗GLP-1R（武漢三鷹生物技術有限公司），兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司），敞箱實驗裝置（武漢一泓科技有限公司），0.25 mm×15 mm針灸針（北京中研太和），SDZ-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）。

1.3 模型制備方法 采用魚藤酮連續灌胃制備PD小鼠模型［7］：將魚藤酮溶于4%羧甲基纖維素和1.25%氯仿溶液的混合液中，按體質量10 mg/kg給藥，每日1次，連續灌胃4周。正常組以同體積生理鹽水灌胃，1次/日，共4周。

1.4 干預方法 NC組：予以同體積生理鹽水灌胃4周后，使用同規格的固定臺捆綁，30 min/次，1次/日，共2周。M組：予魚藤酮連續灌胃4周后，使用同規格的固定臺捆綁，30 min/次，每日1次，共2周。EA組：予魚藤酮連續灌胃4周后，進行電針干預治療。將小鼠捆綁于固定臺后，參照《常用實驗動物穴位定位圖譜》選取“風府”、“足三里”（雙側）、“太沖”（雙側），使用0.25 mm×15 mm一次性針灸針，于“風府”“太沖”直刺3 ～ 5 mm、“足三里”直刺6 ～ 8 mm，針柄連接SDZ-Ⅱ型電子針療儀，正極接“風府”穴，負極接“太沖”穴，連續波，電壓1.6 V，強度1 mA，頻率2 Hz，以穴位出現局部顫動為佳，30 min/次，1次/日，共治療2周。“風府”為固定用穴，“太沖”、“足三里”隔日左右交替使用。DI組：予魚藤酮連續灌胃4周后，采用二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制劑利格列汀［8］［10 mg/（kg·d）］連續灌胃2周，同時使用同規格的固定臺捆綁，30 min/次，每日1次，共2周。

1.5 標本采集 各組小鼠在敞箱實驗結束后即刻取材。每組任取6只小鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4%多聚甲醛灌注固定后取出中腦組織，另6只麻醉后冰上取出新鮮腦組織，留取中腦黑質區域組織塊，置于-80℃冰箱中保存。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 敞箱實驗檢測各組小鼠自主運動的變化情況 各組小鼠于治療結束后次日進行敞箱實驗。設置測試總時間為5 min，將小鼠置于反應箱適應5 min后開始計時，觀察各組小鼠自主運動的總路程、總時間、平均速度的變化情況。

1.6.2 免疫組化法測定中腦黑質中酪氨酸輕化酶（tyrosine hydroxylase，TH） 表達中腦黑質組織采用4%多聚甲醛中固定后，制備厚度為4 μm的石蠟切片。石蠟切片經脫蠟水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶后，山羊血清室溫封閉30 min，TH抗體（1∶200）孵育過夜，二抗孵育20 min，再經DAB顯色、蘇木素復染、脫水、封片后，采集圖像。每張切片選取3個400倍的圖像，采用Image pro plus 6.0軟件計算平均吸光度。

1.6.3 Western blot測定 GLP-1R、PI3K，AKT，GSK-3β蛋白表達水平 取中腦黑質組織20 mg，加入200 μL RIPA裂解液勻漿、裂解后離心（12 000 g，4℃，10 min），取上清液，BCA法測定所提取總蛋白濃度后，將蛋白上清與5×Loading buffer混合，煮沸10 min進行蛋白變性。每組取40 μg總蛋白于PAGE凝膠電泳分離后轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉（磷酸化蛋白用1%的BSA封閉）后，加入GLP-1R（1∶500），p-PI3K（1∶1 000），PI3K（1∶500），p-Akt（1∶500），Akt（1∶500），p-GSK-3β（1∶500），GSK-3β（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。洗去一抗，加酶標二抗（1∶50 000）37℃孵育2 h，加入ECL顯色，采用IPP分析進行相對定量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 20.0進行數據處理，所有數值采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量變化 第4周，與NC組比較，M、EA和DI組魚藤酮造模后小鼠體質量顯著降低（均P＜0.05）。第6周，M、EA和DI三組組間比較體質量差異無統計學意義，見圖1。

圖1 體質量變化Fig.1 Changes of body weight in each group

2.2 各組小鼠自主運動能力比較 與NC組比較，M組小鼠自主運動的總路程縮短、總時間縮短、平均速度降低（均P＜0.01）。與M組比較，EA和DI組小鼠自主運動的總路程延長（均P＜0.01）、總時間延長（P＜0.01，P＜0.05）、平均速度升高（均P＜0.01），且與DI組比較，EA組小鼠的總路程延長和運動總時間延長（均P＜0.01）。見圖2、3。

圖2 小鼠的自主運動軌跡圖像Fig.2 Autonomous motion track image of mice

圖3 各組小鼠自主運動的總路程、總時間、平均速度比較Fig.3 Comparison of total distance,total time and average speed of autonomous movement of mice in each group

2.3 各組小鼠中腦黑質TH表達水平比較 圖中箭頭所指為中腦黑質典型的TH陽性神經元，陽性著色為棕黃或棕褐色。與NC組比較，M組小鼠中腦黑質TH平均吸光度顯著降低（P＜0.01）；與M組比較，EA和DI組小中腦黑質TH平均吸光度均顯著升高（均P＜0.01）。EA組與DI組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠中腦黑質TH陽性表達比較（×400）Fig.4 Comparison of TH positive expression in SN of mice in each group（× 400）

2.4 各組小鼠GLP-1R、PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達水平比較 與NC組比較，M組小鼠中腦黑質 GLP-1R，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平顯著增高（P＜0.01）。與M組比較，EA和DI組GLP-1R，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT蛋白表達水平顯著升高（均P＜0.01），p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。EA組與DI組比較，上述各個指標差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠GLP-1R、PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達水平比較Fig.5 Comparison of protein expression levels of GLP-1R,PI3K,Akt and GSK-3β in each group

3 討論

GLP-1R是G蛋白偶聯受體超家族成員之一，廣泛表達于中樞神經系統［9-10］。相關研究表明，GLP-1R激動劑在神經退行性疾病和糖尿病的動物模型中通過激活參與細胞增殖、生長、存活和修復的通路發揮神經保護作用［11-12］。研究證實，GLP-1R可激活PI3K/AKT通路發揮抗凋亡和神經保護等重要作用［13］。PI3K通過磷酸化AKT蛋白Ser473位點使AKT活化，而活化后的AKT通過p-GSK-3β的Ser9位點抑制GSK-3β活性，避免細胞凋亡的發生［14］。在本研究中，魚藤酮造模后，小鼠黑質中GLP-1R、PI3K、AKT蛋白表達水平顯著下降，GSK-3β蛋白表達水平顯著上升。DPP-4抑制劑通過抑制DPP-4酶的活性，提高體內GLP-1濃度。本研究采用DPP-4抑制劑利格列汀對PD小鼠進行連續2周灌胃的治療。經治療，利格列汀可以有效提高GLP-1R、PI3K、AKT蛋白表達水平，并顯著降低GSK-3β蛋白表達水平。同時，電針亦可上調GLP-1R、PI3K、AKT及下調GSK-3β蛋白表達水平，其干預效果與利格列汀無顯著差異，提示電針和利格列汀對GLP-1R介導的PI3K/AKT/GSK-3β通路均具有一定的調節作用，二者的效應機制可能相同。

PD的病理改變主要表現為中腦黑質致密區多巴胺神經元變性壞死，TH水平能反映出腦內多巴胺神經元的合成量［15-17］，從而可反映PD的病理改變和損傷的程度。研究［18］表明，針刺可明顯改善帕金森病患者黑質致密帶。在本研究中，魚藤酮造模后，小鼠中腦黑質TH表達水平均顯著降低，表明PD模型制備成功。經電針和DPP-4抑制劑干預后，中腦黑質TH水平均顯著升高，表明電針和DPP-4抑制劑可有效提高PD小鼠的中腦黑質TH表達水平。同時，各組小鼠自主運動能力的變化趨勢與TH基本相一致。電針和DPP-4抑制劑可改善PD小鼠的各項行為學表現指標，且電針的干預效果更優。

近來研究顯示，GLP-1R的調控還存在多種途徑，如小鼠的神經營養通路被激活，凋亡信號被抑制［19］。此外，GLP-1/GLP-1R還通過激活環磷酸腺苷、蛋白激酶C，證明了在各種組織中增強抗氧化能力的效果［20］，PI3K/AKT/GSK-3β 通路僅是其中一個分支，各信號轉導通路之間常有交叉。綜上所述，電針治療PD的作用機制可能與GLP-1R介導的PI3K/AKT/GSK-3β通路有關，具體機制有待更深入的探究。