干擾Hsa_circ_0023642調(diào)控miR-653對甲狀腺癌細(xì)胞生物行為的影響

李文強(qiáng) 劉慧穎 任衛(wèi)東

1河北北方學(xué)院研究生學(xué)院（河北張家口 075000）；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科（河北張家口 075000）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，總體上治療效果良好，但仍有一部分難治性甲狀腺癌缺乏有效的治療手段，提高其診斷及治療效率是關(guān)鍵。靶向治療是一種新型的治療技術(shù)，研究甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制，利用相關(guān)分子作為靶點(diǎn)，進(jìn)而研發(fā)靶向藥物進(jìn)行治療，能夠?yàn)榧谞钕侔┗颊邘硇碌南Ｍ?-3］。研究發(fā)現(xiàn)越來越多的非編碼RNA（ncRNA）在人類甲狀腺癌中顯示出異常表達(dá)，miRNA、circRNA等不同RNA分子參與調(diào)節(jié)甲狀腺癌的發(fā)生與進(jìn)展過程，有望作為靶向治療的分子靶點(diǎn)［4-6］。circ_0023642是來源于紫外線抵抗相關(guān)基因（ultraviolet resistanceassociated gene，UVRAG）的 circRNA，位于染色體chr11：75727858-75728024，研究報(bào)道雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）可通過降低circ_0023642抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲［7］。hsa_circ_0023642在胃癌中被上調(diào)，且與胃癌的惡性程度呈高度正相關(guān)；沉默circ_0023642顯著降低了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［8］。circ_0023642可通過調(diào)控miR-508-3p促進(jìn)胃癌GMC-803細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為［9］。然而circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制尚不清楚。生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circ_0023642與miR-653有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-653-5p過表達(dá)可抑制黑色素瘤細(xì)胞生長［10］。hsa_circ_0004771的沉默可通過激活miR-653來抑制乳腺癌的增殖并誘導(dǎo)其凋亡［11］。而miR-653對甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及circ_0023642是否調(diào)控miR-653也尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0023642是否通過調(diào)控miR-653影響甲狀腺癌的細(xì)胞生物學(xué)行為，為甲狀腺癌靶向治療提供理論指導(dǎo)及可能的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 選取本院25例甲狀腺癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，男16例，女9例；年齡29～78歲，平均年齡（64.6±4.4）歲，其中乳頭狀癌14例，濾泡癌3例，髓樣癌3例，未分化癌5例。所有患者經(jīng)病理檢測確診為甲狀腺癌，具有完整臨床病理資料，所有患者均知情且同意。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 甲狀腺癌細(xì)胞SW579購自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基產(chǎn)自美國（由Gibco公司生產(chǎn)）；熒光定量試劑盒購自國內(nèi)（由上海科敏生物科技有限公司制造）；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；凋亡檢測試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；吉姆薩染色液、蛋白提取試劑盒統(tǒng)一采購于國內(nèi)，均由北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)；試驗(yàn)使用的Transwell小室和Matrigel均購自美國，由BD公司生產(chǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒由南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞處理與分組 取對數(shù)生長期甲狀腺癌細(xì)胞 SW579，將 si-NC、si-Hsa_circ_0023642、miRNC、miR-653轉(zhuǎn)染至SW579細(xì)胞中，記為si-NC組、si-Hsa_circ_0023642組、miR-NC組、miR-653組；將si-Hsa_circ_0023642分別與anti-miR-NC、anti-miR-653共轉(zhuǎn)染至SW579細(xì)胞中，記為si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC組、si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-653組。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測Hsa_circ_0023642和miR-653的表達(dá)水平 將組織和細(xì)胞的總RNA分離出來，用以合成cDNA，根據(jù)熒光定量試劑盒的要求進(jìn)行PCR操作，其循環(huán)的條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；使用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。GAPDH和U6分別用作Hsa_circ_0023642和miR-653的內(nèi)參，Hsa_circ_0023642上游引物序列：5′-ATGACAAACTGACGGAAAAGGAG-3′，下游引物序列：5′-AACCAAGGGCAACAGCAATG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；miR-653上游引物序列：5′-ACCAGCTTCAAACAAGTTCACTG-3′，下游引物序列：5′-GCTTCCATCTTATCATTCTTGCA-3′；U6 上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；該引物購自國內(nèi)上海生工生物工程公司。

1.3.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 培養(yǎng)48 h后，在各孔中注入20 μL MTT溶液并孵育4 h，然后添加二甲基亞砜并進(jìn)行震蕩反應(yīng)，用量為150 μL，震蕩時(shí)間為10 min，需使用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測量吸光度（OD）值。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測集落形成數(shù) 使用SW579細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，濃度為1×104個(gè)/mL，然后在六孔板中接種，進(jìn)行為期2周的培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)停止培養(yǎng)，使用PBS清洗，共2次，使用甲醇固定，持續(xù)15 min，使用吉姆薩法染色，持續(xù)30 min，最后采用低倍光學(xué)顯微鏡對計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 對細(xì)胞進(jìn)行為期48 h的培養(yǎng)，PBS漂洗，添加500 μL結(jié)合緩沖液，隨后分別置入Annexin V-FITC和PI溶液中混合，Annexin V-FITC和PI溶液的用量分別為10 μL和5 μL，孵育10 min，孵育期間避免陽光照射。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率，統(tǒng)計(jì)設(shè)備為流式細(xì)胞檢測儀。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白（參考蛋白提取試劑盒說明書執(zhí)行），將其中50 μL的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%牛血清蛋白對其進(jìn)行封閉處理，時(shí)長為60 min；然后添加一抗在4℃條件下放置一夜，添加二抗在室溫條件下放置1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑使其顯影，研究分析其成像的蛋白條帶灰度值，依據(jù)的公式為蛋白表達(dá)水平=目的條帶/GAPDH條帶。

1.3.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測劃痕愈合率 各組細(xì)胞消化后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在盤底用記號筆劃線做標(biāo)記，細(xì)胞鋪滿后用槍頭垂直橫線劃痕，用PBS沖洗劃下的細(xì)胞，換液繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和24 h后觀察，用Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算劃痕愈合率。

1.3.8 Transwell檢測細(xì)胞侵襲數(shù) 將100 μL稀釋后的Matrigel添加到Transwell上室中，并充分混合，凝固后加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加500 μL含血清培養(yǎng)液，培育24 h，結(jié)晶紫染色30 min，使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)抓取5個(gè)視野觀察觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)，倍數(shù)為200倍。

1.3.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建Hsa_circ_0023642的野生型和突變型熒光素酶載體wt-Hsa_circ_0023642和mut-Hsa_circ_0023642，然后和miR-NC、miR-653共同轉(zhuǎn)染至SW579細(xì)胞，熒光素酶的活性依照說明書的要求進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsa_circ_0023642和miR-653在甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 甲狀腺癌組織中Hsa_circ_0023642的表達(dá)水平具有上升趨勢，明顯高于健康組織，而miR-653的表達(dá)水平則呈現(xiàn)出下降趨勢（P＜0.05），見圖1。

圖1 Hsa_circ_0023642和miR-653的表達(dá)Fig.1 Expression of Hsa_circ_0023642 and miR-653

2.2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響 si-Hsa_circ_0023642組的Hsa_circ_0023642水平明顯低于si-NC組，但miR-653、細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)情況均呈上升趨勢，細(xì)胞活性、集落形成數(shù)以及Bcl-2表達(dá)水平呈下降趨勢（P＜0.05），見圖2、表1。

表1 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響Tab.1 The effect of interference with Hsa_circ_0023642 on the proliferation and apoptosis of thyroid cancer cells ±s

表1 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響Tab.1 The effect of interference with Hsa_circ_0023642 on the proliferation and apoptosis of thyroid cancer cells ±s

注：與si-NC組相比，aP＜0.05

分組si-NC si-Hsa_circ_0023642 t值P值Hsa_circ_0023642 1.00±0.00 0.21±0.02a 18.187＜0.001 miR-653 1.00±0.00 3.70±0.14a 33.404＜0.001 OD值1.27±0.09 0.58±0.05a 11.608＜0.001集落形成數(shù)（個(gè)）101.67±3.30 54.00±1.63a 22.433＜0.001凋亡率（%）8.22±0.53 21.97±1.15a 18.808＜0.001 Bax 0.13±0.01 0.63±0.05a 16.984＜0.001 Bcl-2 0.81±0.06 0.25±0.02a 15.336＜0.001

圖2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of interference with Hsa_circ_0023642 on apoptosis and the expression of Bax and Bcl-2 proteins in thyroid cancer cells

2.3 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-Hsa_circ_0023642組細(xì)胞劃痕愈合率降低，侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），見表2。

表2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響Tab.2 The influence of interference with Hsa_circ_0023642 on the migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

表2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響Tab.2 The influence of interference with Hsa_circ_0023642 on the migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

注：與si-NC組相比，aP＜0.05

分組si-NC si-Hsa_circ_0023642 t值P值劃痕愈合率（%）55.70±2.34 34.18±1.60a 13.155＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）149.00±5.35 79.00±2.94a 19.861＜0.001

2.4 Hsa_circ_0023642和miR-653靶向關(guān)系 Hsa_circ_0023642與miR-653有互補(bǔ)序列（圖3）；wt-Hsa_circ_0023642與miR-653轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而mut-Hsa_circ_0023642與miR-653轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化（表3）。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Tab.3 Double luciferase report experiment ±s

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Tab.3 Double luciferase report experiment ±s

注：與miR-NC組相比，bP＜0.05

分組miR-NC miR-653 t值P值wt-Hsa_circ_0023642 0.96±0.08 0.18±0.02b 16.383＜0.001 mut-Hsa_circ_0023642 1.00±0.08 0.96±0.06 0.693 0.527

圖3 Hsa_circ_0023642和miR-653互補(bǔ)序列Fig.3 Complementary sequences of Hsa_circ_0023642 and miR-653

2.5 miR-653對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲的影響 miR-653組的miR-653水平明顯高于miRNC組，細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和Bcl-2表達(dá)水平呈下降趨勢，細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)水平呈上升趨勢（P＜0.05），見圖4、表4。

表4 miR-653對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.4 The effect of miR-653 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

表4 miR-653對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.4 The effect of miR-653 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

注：與miR-NC組相比，bP＜0.05

分組miR-NC miR-653 t值P值miR-653 1.00±0.00 5.09±0.16b 44.276＜0.001 OD值1.29±0.12 0.52±0.03b 10.782＜0.001集落形成數(shù)（個(gè)）101.67±4.50 46.33±1.25b 20.523＜0.001凋亡率（%）8.23±0.54 23.99±1.20b 20.744＜0.001劃痕愈合率（%）56.33±2.31 31.53±1.73b 14.884＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）150.00±6.38 65.67±2.62b 21.178＜0.001 Bax 0.13±0.01 0.83±0.06b 19.932＜0.001 Bcl-2 0.82±0.08 0.17±0.02b 13.653＜0.001

圖4 miR-653對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of miR-653 on the apoptosis of thyroid cancer cells and the expression of Bax and Bcl-2 proteins

2.6 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲的影響 si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-653組的miR-653水平明顯低于si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC組，同時(shí)細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)和Bcl-2均呈上升趨勢，細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)情況呈下降趨勢（P＜0.05），見圖5、表5。

表5 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.5 Inhibition of miR-653 can reverse the effect of interference Hsa_circ_0023642 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

表5 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.5 Inhibition of miR-653 can reverse the effect of interference Hsa_circ_0023642 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

注：與si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC組相比，cP＜0.05

分組si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-653 t值P值miR-653 3.71±0.13 1.50±0.06c 26.735＜0.001 OD值0.57±0.05 1.16±0.08c 10.832＜0.001集落形成數(shù)（個(gè)）55.33±1.25 89.00±3.27c 16.659＜0.001凋亡率（%）21.92±1.16 13.11±0.69c 24.139＜0.001劃痕愈合率（%）34.13±1.80 51.43±2.49c 9.753 0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）77.67±2.49 129.33±4.19c 18.358＜0.001 Bax 0.64±0.05 0.26±0.02c 12.222＜0.001 Bcl-2 0.24±0.02 0.69±0.05c 14.474＜0.001

圖5 抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Inhibition of miR-653 can reverse the effect of interference Hsa_circ_0023642 on the apoptosis of thyroid cancer cells and the expression of Bax and Bcl-2 proteins

3 討論

隨著對腫瘤生物學(xué)和癌癥遺傳學(xué)的認(rèn)識，新型靶向療法已用于甲狀腺癌的治療；了解甲狀腺癌的分子機(jī)制，開發(fā)用于治療甲狀腺癌的靶向藥物具有重要意義［12-14］。已有研究表明多種circRNA參與甲狀腺癌的惡性生物學(xué)行為，如circ_0058124、circ_102171、circ-ABCB10可影響甲狀腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲［15-17］。有研究報(bào)道circ_0023642可促使胃癌細(xì)胞進(jìn)行移動(dòng)與侵襲［18］。而circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)先檢測了甲狀腺癌組織中circ_0023642的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中circ_0023642的表達(dá)水平高于癌旁組織，表明circ_0023642可能在甲狀腺癌中起促癌作用，這是circ_0023642在甲狀腺癌中首次研究報(bào)道。為進(jìn)一步研究circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響，本研究干擾circ_0023642，結(jié)果顯示，細(xì)胞活性及劃痕愈合率呈下降趨勢，集落形成數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，而細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢；表明干擾circ_0023642抑制了甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。提示circ_0023642或可作為甲狀腺癌靶向治療的分子靶點(diǎn)。

研究表明，circRNA可通過microRNA調(diào)節(jié)基因翻譯和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響一系列生物學(xué)過程［19］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過生物學(xué)軟件預(yù)測circ_0023642可能作用的下游miRNA，結(jié)果顯示circ_0023642與miR-653有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-653可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［20］。lncRNA PLK1S1通過調(diào)節(jié)miR-653促進(jìn)了腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和索拉非尼耐藥［21］。ciRs-6以通過使miR-653海綿化抑制膀胱癌的生長［22］。說明miR-653可參與調(diào)控多種腫瘤的進(jìn)展，且受circRNA的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中miR-653表達(dá)水平降低；表明miR-653可能參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，且可能起抑癌基因作用。過表達(dá)miR-653后，細(xì)胞活性、集落形成數(shù)、細(xì)胞劃痕愈合率以及侵襲細(xì)胞數(shù)均呈下降趨勢，而細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢；說明過表達(dá)miR-653可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、集落形成及遷移侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果也表明circ_0023642可對miR-653進(jìn)行靶向調(diào)控；并且抑制miR-653可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0023642對甲狀腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移侵襲的影響，表明circ_0023642可能通過調(diào)控miR-653影響甲狀腺癌的進(jìn)展。miR-653也可作為甲狀腺癌靶向治療的分子靶點(diǎn)。

綜上所述，干擾Hsa_circ_0023642可通過調(diào)控miR-653抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。circ_0023642及miR-653均影響甲狀腺癌進(jìn)展，均可作為甲狀腺癌可能的分子標(biāo)志物及分子治療的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的新穎之處在于發(fā)現(xiàn)了circ_0023642和miR-653在甲狀腺癌中的可能作用。但本實(shí)驗(yàn)主要是在體外細(xì)胞中進(jìn)行，尚未在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，下一步會(huì)繼續(xù)在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。