經典瞬時受體電位通道3基因多態性與原發性高血壓患者微量白蛋白尿的關系

沙熱扎提·依沙江 王蒙蒙 李瑜 陳玉嵐 孫曉靖徐新娟 張向陽

新疆醫科大學第一附屬醫院1高血壓科，2綜合內二科（烏魯木齊 830011）；3新疆醫科大學第七附屬醫院重癥醫學科（烏魯木齊 830063）

原發性高血壓可引起心腦腎及血管等靶器官的損害，其中微量白蛋白尿（microalbuminuria，MAU）是心血管疾病的預測因子和危險因素，是目前臨床上應用最廣泛的高血壓早期腎損害篩查標志物之一［1-3］。MAU與高血壓之間存在雙向關聯，i-SEARCH全球研究［4］顯示全球高血壓患者中MAU的總患病率為58.4%，另一項中國成年人縱向研究［5］發現MAU者患高血壓風險增加75%。高血壓MAU產生的潛在機制與腎小球濾過屏障中內皮細胞（endothelial cell，EC）的功能障礙有關［6-7］，而瞬時受體電位通道3（transient receptor potential channel，TRPC3）通過調節細胞內Ca2+濃度參與EC功能障礙的過程［8-10］，提示TRPC3可能與高血壓產生MAU相關，TRPC3主要受控于TRPC3基因。本研究以原發性高血壓患者為研究對象，評估TRPC3基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與MAU之間的相關性，以期為高血壓早期腎損害的干預研究提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年4月至2017年12月于新疆醫科大學第一附屬醫院高血壓科住院并確診為原發性高血壓的患者449例，其中女143例，男306例；平均年齡（47.27±10.17）歲。納入標準：（1）以《中國高血壓防治指南2010年版》［11］為高血壓診斷依據；（2）年齡18 ～ 65歲；（3）所選患者均為漢族，且患者之間無一、二級親屬關系；（4）經醫學倫理委員會批準后，簽署知情同意并且自愿參與該次研究患者。排除標準：（1）繼發性高血壓；（2）腎小球腎炎、腎病綜合征、IgA腎病等腎臟疾??；（3）嚴重心、肝、腎功能不全；（4）血糖控制欠佳的糖尿病、甲狀腺功能亢進癥、甲狀腺功能減退癥等內分泌系統相關疾??；（5）慢性消耗性疾病和惡性腫瘤；（6）目前口服腎毒性藥物；（7）因各種原因無法配合完成該研究及臨床資料不全者。

1.2 分組 根據是否合并微量白蛋白尿分單純高血壓組（EH組）378例和高血壓合并MAU組（EH+MAU組）71例。MAU診斷標準：根據《中國高血壓防治指南2010年版》建議，24 h尿微量白蛋白在30～300 mg為MAU。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料收集 包括入院時間、性別、年齡、吸煙史、飲酒史、家族史，測量身高、體質量，計算體質量指數（BMI）。

1.3.2 血液指標測定 所有研究對象禁食8 h，次日清晨抽取空腹肘靜脈血，采用羅氏C8000全自動生化儀分析空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、胱抑素C、維生素D、同型半胱氨酸（Hcy）等。

1.3.3 尿微量白蛋白測定 患者正常飲食，當日清晨8點，排掉首次小便，此后每次小便全部留在清潔的容器中，次日清晨8點記錄容器中尿量，搖勻后取留10～20 mL尿標本送檢，采用貝克曼Dxc800全自動生化分析儀檢測24 h尿微量白蛋白。

1.3.4 血壓測量 采用美國welch Allyn動態血壓監測儀6100監測，記錄24 h平均收縮壓（24 h SBP）、24 h平均舒張壓（24 h DBP）、24 h平均脈壓。

1.3.5 TRPC3基因多態性檢測

1.3.5.1 DNA提取 采取清晨空腹肘靜脈血5 mL，-70℃冷凍保存待測；按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說明方法提取DNA；用紫外分光光度計測量DNA濃度和純度。

1.3.5.2 PCR擴增分型 使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design軟件設計TRPC3基因5個位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物。采用多重PCR技術進行PCR擴增，PCR引物見表1。檢測結果使用TYPER 4.0軟件分型并輸出結果。

表1 PCR引物Tab.1 PCR primer

1.4 統計學方法 使用SPSS 23.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Hardy-Weinberg檢驗比較兩組間是否具有群體代表性，P＞0.05為符合Hardy-Weinberg平衡。應用logistic回歸模型分析影響尿微量白蛋白的獨立相關因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較 兩組間年齡、BMI、甘油三酯、24 h平均收縮壓、24 h平均舒張壓差異有統計學意義（P＜0.05），具余指標差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表2。

表2 EH組與EH+MAU組一般臨床資料對比Tab.2 Comparison of general clinical data of EH group and EH+MAU group ±s

表2 EH組與EH+MAU組一般臨床資料對比Tab.2 Comparison of general clinical data of EH group and EH+MAU group ±s

年齡（歲）男［例（%）］吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］家族史［例（%）］高血壓病程（月）BMI（kg/m2）空腹血糖（mmol/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）高密度脂蛋（mmol/L）低密度脂蛋（mmol/L）維生素D（nmol/L）同型半胱氨酸（μmol/L）胱抑素C（mg/L）24 h平均收縮（mmHg）24 h平均舒張（mmHg）24 h平均脈壓（mmHg）EH組（n=378）47.77±10.05 251（66.40）151（39.95）143（37.83）257（67.99）62.03±73.15 26.27±3.22 4.84±0.92 5.26±1.37 71.01±15.79 1.90±1.35 4.23±0.89 1.13±0.30 2.80±0.73 36.42±17.07 14.32±8.00 1.63±14.94 133.66±13.13 84.42±11.28 49.24±8.28 EH+MAU組（n=71）44.58±10.45 55（77.46）34（47.89）27（38.03）48（67.61）74.73±78.95 28.02±3.92 4.96±1.26 5.38±1.37 72.92±18.87 2.57±2.74 4.16±0.87 1.07±0.28 2.67±0.69 34.91±23.23 14.53±8.58 1.02±1.29 144.27±16.85 93.09±13.00 51.18±8.49 P值0.015 0.072 0.238 1.000 1.000 0.186＜0.001 0.352 0.484 0.365 0.046 0.534 0.125 0.190 0.538 0.843 0.734＜0.001＜0.001 0.072

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 兩組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗（P＞0.05），具有群體代表性。

2.3 EH組與EH+MAU組基因頻率的比較 兩組rs953691位點基因型分布、等位基因及顯性模型（GG/GT+TT）差異有統計學意義（P＜0.05），余位點基因型分布及各模型差異均無統計學意義（P ＞0.05），見圖1。

圖1 EH組與EH+MAU組基因頻率分布Fig.1 Frequency distribution of EH group and EH+MAU group

2.4 Logistic回歸分析 以MAU為因變量，年齡、BMI、甘油三酯、24 h平均收縮壓、24 h平均舒張壓和TRPC3基因rs953691顯性模型基因型為自變量，進行logistic回歸分析，結果顯示：甘油三酯、24 h平均收縮壓（≥150 mmHg）和rs953691 GG基因型為原發性高血壓患者出現MAU的獨立危險因素，見表3。

表3 原發性高血壓患者微量白蛋白尿影響因素的logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of factors influencing microalbuminuria in essentialhypertension patients

3 討論

TRPC3是TRPC家族中具有代表性且非常重要的一個亞群，主要受控于TRPC3基因。人類TRPC3基因由位于4號染色體上的13個外顯子組成。近年大量研究成果已證實，TRPC3在腎小管、腎間質、腎上皮及脈管系統中表達并參與不同類型的腎臟疾病。在慕尼黑大鼠腎皮質中TRPC3表達增高，且與蛋白尿有關［12］；敲除TRPC3基因可改善梗阻腎引起的腎小管間質損傷和腎纖維化［13］；另外，聯合敲除TRPCs（包括TRPC3）可降低糖尿病小鼠腎功能不全的易感性［14］。然而TRPC3基因多態性在原發性高血壓腎損害中的作用尚不明確。

本研究結果顯示，EH+MAU組患者BMI、甘油三酯、24 h平均血壓水平明顯高于EH組，與RAIKOU等［15］、KUANG等［16］結果一致。Logistic回歸顯示，排除混雜因素后甘油三酯和24 h平均收縮壓（≥150 mmHg）仍是原發性高血壓合并MAU的獨立危險因素。另外發現，EH+MAU組患者較EH組年齡小，與AL-SHARIFI等［17］研究結論相反，可能原因考慮：（1）EH+MAU組更高的血壓、血脂、BMI水平使患者更早出現MAU。（2）AL-SHARIFI等［17］研究納入的病患為伊拉克人群，而本研究為中國漢族人群，這種差異可能與地理區域和遺傳因素相關；（3）AL-SHARIFI等［17］研究，患者平均年齡（59.0±7.2）歲，而本研究患者平均年齡為（47.27±10.17）歲，抽樣人群年齡差異可能導致研究結果不一致。因此，在強調血壓、血脂達標的基礎上，更好地控制體質量是預防高血壓患者MAU的重要策略之一。

TRPC3的5個位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明具有群體代表性?；蝾l率的比較結果顯示，rs953691位點基因型、等位基因及顯性模型在兩組之間存在統計學差異，推測rs953691位點的變異可能是高血壓合并MAU的危險因素。進一步行logistic回歸分析顯示，TRPC3基因rs953691位點GG基因型的高血壓患者發生微量白蛋白尿的風險性是GT+TT基因型的2.169倍，提示TRPC3基因多態性是高血壓合并MAU的獨立危險因素?？赡軝C制如下：（1）TRPC3在高血壓患者內皮細胞中高表達，其誘導的Ca2+作用于內皮骨架中的肌球—肌動蛋白，引起內皮細胞膜流動性增加進而破壞腎小球濾過屏障的結構和功能［9，18］。（2）TRPC3參與 RAAS 系統激活并釋放血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）［19］，AngⅡ損傷腎小球內皮細胞、系膜細胞，打破腎血管自我調節能力，引起腎小球高壓力、高濾過［20］。（3）TRPC3 通過 Ca2+介導的信號調節激酶控制腎成纖維細胞增殖、分化和活化，使腎間質纖維化和腎小管損害，進而加重腎損傷［21］。

綜上所述，高血壓早期出現MAU是環境和遺傳因素共同影響的結果。血壓、甘油三酯和TRPC3基因多態性是高血壓患者MAU的獨立風險因素。TRPC3基因rs953691位點的GG基因型可能增加高血壓患者MAU發生的風險。進一步深入研究TRPC3基因的功能和作用機制可以為高血壓患者MAU的早期診斷及有效防控提供理論依據。

本研究新穎之處：探討TRPC3基因多態性與原發性高血壓患者MAU的關系，明確了rs953691位點的GG基因型與高血壓患者MAU具有相關性，為高血壓早期腎損害的干預提供了新思路。不足之處：本研究對象全部來自同一家醫院的住院患者，可能存在選擇偏移，此外本研究樣本量較小，未設健康對照組。下一步研究方向：納入健康人群，擴大樣本量，對研究對象進行長期隨訪和多中心研究，進一步行動物實驗驗證。