離子型GABA受體新型拮抗劑的虛擬篩選

趙 錦，王雯潔，王晨晨，巨修練

(1.湖北輕工職業技術學院，湖北 武漢 430070；2.輝瑞(武漢)研究開發有限責任公司，湖北 武漢 430000；3.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經系統中重要的抑制性遞質，可作用于細胞膜上的GABA門控氯離子通道(GABA-gated chloride channel，GABACl)，使氯離子內流導致細胞膜超極化，從而抑制生物體的神經活動[1-3]。GABACl是一種五聚體蛋白，又被稱為離子型GABA受體(以下簡稱GABA受體)，廣泛存在于昆蟲的神經和肌肉細胞中。GABA受體的拮抗劑已有很多被開發成農用殺蟲劑，如氟蟲腈等，但隨著該類殺蟲劑的大量使用，出現了害蟲抗藥性和環境不友好等問題[1-3]。近年來報道的兩類新型GABA受體拮抗劑：異噁唑啉類化合物(如Fluralaner)[3-5]和間二酰胺類化合物(如BPB-1)[6-7]，它們可以作用于GABA受體的一個新位點，同時選擇性高，對哺乳動物低毒甚至無毒，較傳統殺蟲劑更安全[8]。因此，基于GABA受體的這一新作用位點研究Fluralaner等異噁唑啉類化合物的作用機制，可以為合理設計新型安全高效殺蟲劑提供重要的理論依據。

探尋與Fluralaner具有相似作用機制和活性結構的新化學實體具有重要意義。作者采用分子模擬和計算機輔助藥物設計方法，以序列一致性較高的人GABA受體為模板，同源模建黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)GABA受體的三維結構，探索Fluralaner的作用模式，并通過藥效團模型和分子對接的虛擬篩選探尋GABA受體拮抗劑的新型苗頭化合物。

1 實驗

1.1 藥效團模型的構建和驗證

選擇10個結構多樣且活性高的Fluralaner衍生物(表1)用于藥效團模型的構建[9]，運用SYBYL-X 2.1軟件Sketch模塊構建這10個化合物，并通過Compute命令對化合物的分子結構進行能量優化，獲取合理的分子構象。具體方式如下：設定Tripos立場，添加Gasteiger-Huckel電荷，終止時的梯度差設為0.005kcal·mol-1·?-1，最大重復次數設為1 000，其余參數保持不變。藥效團模型的構建通過SYBYL-X 2.1軟件Galahad模塊完成，參數設置為系統默認。

表1 10個Fluralaner衍生物的化學結構及其對草地貪夜蛾的殺蟲活性(LC50)

為了驗證構建的藥效團模型是否具有良好的識別活性化合物的能力，采用誘餌集方法計算陽性分子富集因子(enrichment factor，EF)來評價模型的可靠性，計算公式如下：

式中：TP為命中陽性分子的數量；n為所有命中分子的數量；A為所有陽性分子的數量；N為數據庫的分子數量。

誘餌集方法的實驗步驟如下：從ZINC數據庫中選擇338個無活性的化合物分子，同時選出12個已知活性但未用于構建藥效團模型的分子共同作為陽性參照分子，然后將這350個分子進行能量優化后構建一個小型數據庫用于虛擬篩選。通過SYBYL-X 2.1軟件Unity模塊將構建的藥效團模型生成提問式，對該數據庫進行搜索，計算富集因子。

1.2 同源模建

1.2.1 模型構建

從UniProt數據庫中下載黑腹果蠅GABA受體β亞基序列(編號：P25123)，通過序列比對發現人GABA受體(PDB ID：4COF)β亞基與其序列一致性最高，為46.28%，故選用人GABA受體蛋白4COF作為模板。在同源模建前刪去模板蛋白小分子配體，通過Swiss-model網站自動執行黑腹果蠅GABA受體的同源模建。

1.2.2 蛋白優化

采用GROMACS 2016.5軟件對模建的黑腹果蠅GABA受體蛋白進行3 ns的自由模擬以消除不合理的鍵長、鍵角和扭轉角。利用pdb2gmx命令在AMBER99SB立場下生成蛋白的拓撲文件[10]，然后將模型置于填充有TIP3P水模型和氯離子的立方體盒子中。為消除不合理的范德華力，通過多次迭代計算使模型能量收斂到10 kJ·mol-1，接著使整個體系在300 K恒溫條件下達到NVT和NPT平衡，最后進行3 ns時長的自由模擬[3，11]。

1.2.3 蛋白評價

通過SAVEs在線蛋白檢測服務器(http://services.mbi.ucla.edu/saves/)和PROSA程序(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)來評價蛋白模型[3]。利用PROCHECK方法進行拉氏圖評價，同時結合Z-score分布圖來驗證蛋白模型的質量。

1.3 分子對接

運用SYBYL-X 2.1軟件Surflex-Dock Geom模塊進行分子對接實驗。在對接之前需要進行蛋白質準備，在對動力學優化后的蛋白質進行結構分析之后，對其進行側鏈修復、末端處理、加氫、加電荷等優化。同源模建的蛋白質三維結構中不包含共晶配體，因此使用殘基模式來設定結合口袋。文獻報道，Fluralaner等異噁唑啉類化合物與黑腹果蠅GABA受體相互作用的關鍵氨基酸可能是Ile218、Leu222、Gly277、Phe280、Val281[12-13]，因此選擇黑腹果蠅GABA受體模型A鏈上的Ile218、Leu222和B鏈上的Gly277、Phe280、Val281附近3 ?以內的氨基酸來定義結合口袋[3]。

1.4 虛擬篩選

通過基于配體的藥效團篩選和基于受體的分子對接對ZINC數據庫中可購買的22 724 825個化合物進行虛擬篩選。首先將構建的藥效團模型生成提問式，采用Flex Search對ZINC數據庫進行初步篩選，然后將初篩所得的分子對接到模建蛋白的結合口袋中，結合Total_Score和Cscore值進行進一步篩選。觀察經過兩次篩選后的小分子與GABA受體的結合模式，優先考慮能與結合口袋中關鍵氨基酸形成相互作用的化合物。

2 結果與討論

2.1 藥效團模型

最優的藥效團模型分子疊合圖如圖1所示。

：疏水中心 ：氫鍵受體 ：正氮原子

該模型具有3個氫鍵受體(AA_1、AA_6、AA_7)、5個疏水中心(HY_3、HY_9、HY_4、HY_2、HY_8)和1個正氮原子(NP_5)，代表了異噁唑啉類化合物的關鍵藥效結構特征。計算表明，該模型具有相對高的Specificity值(5.394)和相對低的Energy值(-0.51 kcal·mol-1)，富集因子為15.4，遠大于1，證明該藥效團模型具有較好的活性分子識別能力，故利用藥效團模型進行后續的虛擬篩選具有合理性。

2.2 同源模建

2.2.1 序列比對

同源模建是預測目標蛋白質合理三維結構的有效方法，模板的選擇和序列比對的精確度是決定模建蛋白質質量的重要因素。黑腹果蠅GABA受體β亞基和人GABA受體β亞基的序列一致性為46.28%，符合建模要求。此外，在解析人GABA受體4COF的三維結構時，在TM3和TM4的細胞內環區域氨基酸Arg357～Ser564被序列SQPARAA替換[14]，故黑腹果蠅的GABA受體β亞基序列的相同位置也用SQPARAA替換。黑腹果蠅GABA受體β亞基和人GABA受體β亞基的序列比對如圖2所示，整個跨膜區域(TM1～TM4)氨基酸殘基的一致性和相似性較高，因此選擇人GABA受體作為模板具有合理性。

圖2 黑腹果蠅與人GABA受體β亞基的序列比對Fig.2 Sequence alignment of GABA receptor β subunits of Drosophila melanogaster and human

2.2.2 蛋白優化

同源模建后的蛋白質通過3 ns分子動力學模擬進行優化，在模擬過程中，黑腹果蠅GABA受體結構的勢能變化和骨架碳原子(Cα)的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)如圖3所示。

由圖3a可以看出，當能量收斂到設置范圍10 kJ·mol-1時，優化步數達到2 718步，此時整個蛋白質體系達到能量最小化。由圖3b可以看出，在1 600 ps后，黑腹果蠅GABA受體RMSD值達到收斂，穩定在0.16 nm左右，這表明所得模型已基本達到穩定狀態，可用于分子對接。

圖3 黑腹果蠅GABA受體模型的3 ns分子動力學模擬過程中的勢能(a)和骨架碳原子RMSD(b)變化Fig.3 Potential energy(a) and carbon skeleton RMSD(b) of Drosophila melanogaster GABA receptor model during 3 ns molecular dynamics simulation

2.2.3 蛋白評價

模建得到黑腹果蠅GABA受體的PROCHECK結果(圖4左)表明，模型中落在最佳和允許區域的氨基酸殘基總和為99.6%。因此，經過動力學優化后的黑腹果蠅GABA受體的二面角是合理的。描述模型質量的Z-score分布圖(圖4右)顯示，黑腹果蠅GABA受體模型的Z-score值為-3.16，落在了已知結構蛋白的Z-score值形成的分布區內，這表明模型能量也是合理的。上述評價結果表明，構建的黑腹果蠅GABA受體模型結構和能量均較為合理，可運用于分子對接研究。

圖4 黑腹果蠅GABA受體模建蛋白的拉氏圖(左)和Z-score圖(右)Fig.4 Ramachandran plot(left) and Z-score plot(right) of optimized GABA receptor model of Drosophila melanogaster

2.3 分子對接

Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體的對接模式如圖5所示。對接打分Total_Score值為5.47，Cscore值為5，表明其與黑腹果蠅GABA受體有較強的結合能力[15-16]。

從圖5可以看出，Fluralaner垂直地插入到黑腹果蠅GABA受體模型TM1和TM3之間靠近細胞外膜的間隙區域(圖5a)，其含有三氟甲基的脂肪尾鏈嵌入2個亞基之間，并通過與Ile218、Leu222、Leu250、Met256形成疏水作用來維持自身與蛋白質結合的穩定性[3]。而Fluralaner空間位阻較大的異噁唑啉環(B)和苯環(C)未能完全嵌入該口袋中(圖5b)。此外，Fluralaner異噁唑啉環上的O原子和N原子均能與殘基Ala285形成氫鍵作用(表2)，同時苯環(B)可與殘基Phe280形成π-π相互作用(圖5b)，這些作用可能是Fluralaner與GABA受體穩定結合的原因。

圖5 Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體的對接模式Fig.5 Docking mode of Fluralaner with Drosophila melanogaster GABA receptor

表2 Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體結合形成的氫鍵

2.4 虛擬篩選

根據所建立的藥效團模型和分子對接方法，對ZINC可購買小分子數據庫進行3輪虛擬篩選。在第1輪篩選中，利用Unity模塊將最優的藥效團模型轉化成提問式，對ZINC可購買化合物數據庫進行搜索，得到18 886個化合物，然后以QFIT>50為標準篩選出115個化合物；在第2輪篩選中，通過SYBYL-X 2.1軟件Surflex-Dock Geom模塊將這115個化合物對接到黑腹果蠅GABA受體的結合口袋中，綜合考慮候選化合物的Total_Score值和Cscore值，選擇排名前20且打分高于Fluralaner的化合物作為備選；在第3輪篩選中，通過觀察候選化合物與氨基酸殘基Leu222、Met256、Phe280、Ala285的相互作用來判斷對接模式是否具有合理性，從而剔除14個化合物，最終得到6個苗頭化合物，其對接打分見表3,化學結構見圖6。

圖6 篩選得到的6個苗頭化合物的化學結構Fig.6 Chemical structures of screened six hit compounds

表3 篩選得到的6個苗頭化合物的對接打分

化合物N1與黑腹果蠅GABA受體的對接模式

如圖7所示。

圖7 化合物N1與黑腹果蠅GABA受體的對接模式Fig.7 Docking mode of compound N1 with Drosophila melanogaster GABA receptor

由圖7可知，與Fluralaner類似，化合物N1垂直地插入黑腹果蠅GABA受體模型TM1和TM3之間(圖7a)，但深度不及Fluralaner，這可能是因為N1苯環支鏈的體積比Fluralaner脂肪長鏈更大，容易與氨基酸發生碰撞，不利于深入結合口袋[3]。此外，化合物N1可以與Phe280形成π-π堆積作用，與氨基酸殘基Ile218、Pro219、Met256、Asp273、Leu276、Val281形成疏水作用。化合物N1與Ala285并未形成氫鍵作用，但卻可以與Gln215、Met256、Asn260等氨基酸形成氫鍵作用。

3 結論

針對黑腹果蠅離子型GABA受體靶標及其新型拮抗劑進行了系統分子模擬，構建了異噁唑啉類化合物Fluralaner的藥效團模型，通過同源模建和分子對接探索了Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體的可能作用模式。隨后基于藥效團以及分子對接的虛擬篩選，發現了6個潛在的黑腹果蠅GABA受體新型拮抗劑，為靶向GABA受體新型殺蟲劑的設計和研究提供了重要理論依據。