溫度對黑豆皮活性成分、抗氧化和抗腫瘤活性的影響

胡懿化，魯靜武，何嘉琦，王星滟，張武霞*，李 鵬，張永坡，高春艷，岳愛琴，杜維俊，趙晉忠*

(1.山西農業大學基礎部，山西 太谷 030801；2.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801)

隨著人們生活質量的提高、保健意識的增強，保健食品受到人們青睞。如大蒜具有極好的抗菌效果，能夠預防血管老化、增強機體免疫力、預防感冒[1]；胡蘿卜、洋蔥等具有預防和治療夜盲癥、降糖降脂的作用[2-3]；植物大豆含有豐富的蛋白質、多種氨基酸及微量元素，能夠增強人體的免疫功能和記憶力[4]。黑豆是一種藥食同源的豆科植物，我國約有2 980份種質資源，其中青仁黑豆的藥用價值最高，具有抗氧化、降血脂、降血壓、改善貧血、預防癌癥、預防肥胖、抗腫瘤等功效[5]。Mu等[6]從黑豆皮中獲得的提取物能夠明顯提高機體血液中鐵含量，促進機體造血功能，改善貧血；洪迪清等[7]發現黑豆中的三羥基異黃酮能夠有效抑制肺癌、肝癌、結腸癌、食道癌等癌癥的發生，也可預防和治療高血壓、腦血栓，維護心臟功能。因此，開發利用黑豆資源具有重要意義。

作者在不同溫度下浸提黑豆皮，對黑豆皮提取物中的總黃酮、總酚、花青素、碳水化合物、蛋白質和糖醛酸等6種活性成分進行分析，同時探究其抗氧化活性及抗腫瘤活性，以期為黑豆皮資源的商品化開發奠定理論基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

太谷青仁黑豆1號，產于山西太谷縣；人胃腺癌細胞株(BGC-823)、宮頸癌細胞株(HeLa)、人大細胞肺癌細胞株(NCI-H460)，自行保存；細胞培養基(RPMI-1640，DMEM)，美國HyClone公司。

噻唑藍(MTT)、蘆丁標準品、沒食子酸標準品、葡萄糖標準品、牛血清蛋白標準品、半乳糖醛酸標準品，北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶，四季青生物公司。

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮提取物的制備

收集高品質黑豆皮，凈水清洗3遍，80 ℃不斷翻攪下烘焙40 min；稱取適量干黑豆皮4份，分別用70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的蒸餾水浸提30 min，過濾，濾液濃縮、凍干，即得黑豆皮提取物。

1.2.2 黑豆皮提取物中6種活性成分的測定

以蘆丁為標準品，采用Al(NO3)3絡合分光光度法測定黑豆皮提取物中總黃酮的含量[8]；以沒食子酸為標準品，采用福林酚法測定黑豆皮提取物中總酚的含量[9]；參照pH示差法測定黑豆皮提取物中花青素的含量[10]；以葡萄糖為標準品，采用硫酸-苯酚法測定黑豆皮提取物中碳水化合物的含量[11]；以牛血清蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍染色法測定黑豆皮提取物中蛋白質的含量[12]；以半乳糖醛酸為標準品，采用間羥基聯苯法測定黑豆皮提取物中糖醛酸的含量[13]。

比較黑豆皮提取物中6種活性成分的含量，確定合適的浸提溫度。

1.2.3 黑豆皮提取物抗氧化活性的測定

取合適溫度下浸提的黑豆皮提取物，溶解并稀釋成不同濃度，測定其總還原力和對DPPH自由基的清除能力，體外評價其抗氧化活性[14-15]。具有還原能力的化合物能將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，并與三氯化鐵發生顯色反應，產物在702 nm處顯色，基于此，可通過測定702 nm處吸光度(OD702)來判斷化合物還原能力的強弱，OD702值越大，說明還原能力越強。DPPH自由基能夠和抗氧化劑反應，測定溶液在517 nm處吸光度，通過計算DPPH自由基清除率來判斷抗氧化劑的活性，DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越高[16]。

1.2.4 黑豆皮提取物抗腫瘤活性的測定

取合適溫度下浸提的黑豆皮提取物，通過MTT法體外評估其對BGC-823、HeLa、NCI-H460細胞株增殖活性的影響[17]。將對數生長期的BGC-823、HeLa、NCI-H460細胞株分別用胰蛋白酶消化，并分別用含10%(體積分數)胎牛血清的RPMI-1640培養基和DMEM培養基制成細胞懸液；接種于96孔板，密度為1×106個·mL-1，待細胞貼壁后，加入不同濃度(0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1)合適溫度下浸提的黑豆皮提取物溶液，置于37 ℃培養箱中培養24 h；加入MTT處理4 h，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，測定570 nm處吸光度(OD處理組)。以磷酸鹽緩沖液替代黑豆皮提取物溶液作為空白組，同法測定570 nm處吸光度(OD空白組)，按下式計算抑制率(%)：

1.3 數據分析

實驗數據用Excel計算平均值和標準差，使用GraphPad Prism 5.0軟件完成統計繪圖。

2 結果與討論

2.1 黑豆皮提取物中活性成分分析

在70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下浸提的黑豆皮提取物中的總黃酮、總酚、花青素、碳水化合物、蛋白質和糖醛酸等6種活性成分的含量如圖1所示。

圖1 黑豆皮提取物中6種活性成分的含量Fig.1 Contents of six active components in black bean hulls extract

由圖1可知，黑豆皮提取物中的總黃酮、總酚、花青素、蛋白質和糖醛酸等5種活性成分的含量隨著浸提溫度的升高均呈先升高后降低的趨勢，在90 ℃時總黃酮、總酚、蛋白質和糖醛酸的含量達到最高，分別為(11.555±0.160)%、(1.454±0.070)%、(13.096±0.600)%、(21.587±1.570)%；在80 ℃時花青素的含量達到最高，為(0.199±0.003)%；而黑豆皮提取物中碳水化合物的含量隨著浸提溫度的升高持續升高，在90 ℃時為(61.453±5.030)%，100 ℃時達到(65.566±1.448)%。

采用1.2.1方法在不同溫度下浸提的黑豆皮提取物的提取率順序為：90 ℃(7.957%)>100 ℃(7.904%)>70 ℃(5.356%)>80 ℃(5.343%)。綜合考慮，選擇合適的浸提溫度為90 ℃，在此溫度下浸提能夠最大程度地保留黑豆皮中的各種活性成分。

2.2 黑豆皮提取物的抗氧化活性分析

取80 ℃、90 ℃下浸提的黑豆皮提取物，體外測定其總還原力和DPPH自由基清除率，結果如圖2所示。

圖2 黑豆皮提取物的總還原力(a)和DPPH自由基清除率(b)Fig.2 Total reducing power(a) and DPPH free radical scavenging rate(b) of black bean hulls extract

由圖2可知，90 ℃浸提的黑豆皮提取物的總還原力和DPPH自由基清除率均高于80 ℃浸提的；且2種溫度下浸提的黑豆皮提取物的總還原力和DPPH自由基清除率均隨提取物濃度的增加逐漸升高，呈線性關系。90 ℃浸提的黑豆皮提取物濃度為0.8 mg·mL-1時，其還原鐵離子和對DPPH自由基的清除能力均達到最強，鐵離子還原氧化值和DPPH自由基清除率分別達到1.364±0.120和(76.00±0.02)%。

2.3 黑豆皮提取物的抗腫瘤活性分析

取80 ℃、90 ℃下浸提的黑豆皮提取物，體外測定其對BGC-823、HeLa、NCI-H460細胞株增殖活性的影響，結果如圖3所示。

圖3 黑豆皮提取物對BGC-823(a)、HeLa(b)、NCI-H460(c)細胞株增殖活性的影響Fig.3 Effect of black bean hulls extract on proliferative activity of BGC-823(a),HeLa(b),and NCI-H460(c)

由圖3可知，黑豆皮提取物具有抑制癌細胞增殖的作用。在濃度為0.25～2 mg·mL-1時，80 ℃下浸提的黑豆皮提取物能夠抑制BGC-823細胞株增殖，并呈濃度依賴關系，在濃度為0.125～2 mg·mL-1時，90 ℃下浸提的黑豆皮提取物也能夠抑制BGC-823細胞株增殖，并呈濃度依賴關系(圖3a)；在濃度為0.5～2 mg·mL-1時，黑豆皮提取物能夠抑制HeLa細胞株增殖，并呈濃度依賴關系(圖3b)；在濃度為0.5～2 mg·mL-1時，黑豆皮提取物能夠抑制NCI-H460細胞株增殖，并呈濃度依賴關系(圖3c)。90 ℃下浸提的黑豆皮提取物在濃度為0.125 mg·mL-1時就對BGC-823細胞株的增殖具有一定抑制效果，說明其對人胃腺癌細胞更加敏感。

2.4 討論

有報道指出，黑豆中含有豐富的黃酮類化合物、多酚類化合物、碳水化合物、蛋白質和維生素等，能夠增強機體免疫力并調節機體激素水平，有效減輕婦女更年期綜合癥癥狀[18]。本研究對黑豆皮提取物中6種活性成分的熱穩定性進行研究，發現90 ℃浸提的黑豆皮提取物中總黃酮、總酚、蛋白質和糖醛酸的含量最高，而花青素在80 ℃時保留最多，碳水化合物在100 ℃時保留最多。這是由于，總黃酮、總酚等物質的性質較穩定，在一定范圍內隨著溫度的升高提取量逐漸增加[19-20]；花青素是一種熱敏性較高的物質，結構不穩定，溫度越高越容易被氧化分解[21]；碳水化合物是生命細胞結構的主要成分和供能物質，具有調節細胞活動的重要功能，眾多研究表明溫度對碳水化合物結構與性質的影響較小[22]，因此，100 ℃浸提的黑豆皮提取物中碳水化合物含量最高。

已有大量的生物學和醫學研究證實，氧化應激是導致各種疾病發生的關鍵機制，減少機體內自由基的產生是有效調節氧化應激的重要策略[23]。機體內過多的活性氧(如氧自由基)引起的氧化應激是人類多種疾病發生發展與人體衰老的一個重要因素[24]。植物中抗氧化活性成分主要有黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素和多糖等，其中花青素是目前最有效的抗氧化劑，也是最強效的自由基清除劑[25-26]。

本研究發現黑豆皮提取物具有較強的抗氧化活性，對DPPH自由基的清除率達到了(76.00±0.02)%，鐵離子還原氧化值達到了1.364±0.120。這與李勇等[27]研究發現黑豆皮具有抗氧化活性的結果相印證。同時推測槲皮素、異鼠李素、染料木素、豆素和原兒茶酸甲酯等物質與花青素、多糖協同參與了黑豆皮提取物的抗氧化作用，有效地抑制和清除自由基，減少機體的氧化損傷。

本研究還發現黑豆皮提取物能夠有效抑制BGC-823、HeLa和NCI-H460細胞株的增殖。低濃度時，黑豆皮提取物促進癌細胞增殖；達到一定濃度時，抑制癌細胞增殖。這應該與黑豆皮提取物中各活性成分所占比例有關。黑豆皮提取物中碳水化合物等營養物質含量高，所以低濃度時營養物質首先提供營養和能量促進癌細胞增殖，隨著濃度的升高，花青素、黃酮等具有抗腫瘤活性的化合物發揮作用，抑制癌細胞增殖。Singh等[28]和Wang等[29]研究發現，大豆皂酚B和染料木黃酮能夠促進大腸癌細胞的凋亡和自噬，誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成，因此推測黑豆皮提取物中可能含有皂酚B、染料木黃酮等其它活性成分協同參與了抗腫瘤作用。

3 結論

在90 ℃下用蒸餾水浸提黑豆皮獲得的黑豆皮提取物中總黃酮、總酚、蛋白質和糖醛酸保留最多，含量分別為(11.555±0.160)%、(1.454±0.070)%、(13.096±0.600)%、(21.587±1.570)%；花青素含量在80 ℃浸提時達到最高，為(0.199±0.003)%；而碳水化合物的含量則在100 ℃浸提時達到最高，為(65.566±1.448)%。黑豆皮提取物具有顯著的抗氧化和抗腫瘤活性，能夠有效抑制機體自由基的產生，增強免疫力，預防和抑制機體發生癌變，降低癌癥發生幾率。表明黑豆皮提取物能夠作為一種天然抗氧化或抗腫瘤的調節劑應用于食品藥品行業，為黑豆皮資源的產業化開發利用奠定了重要基礎。