不同酶對巫山淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C含量的影響及抑菌活性研究

謝娟平，常永宏，強世喜，劉春陽，陳嘉悅

(1.安康學院醫學院，陜西 安康 725000；2.安康學院 秦巴中藥資源研發中心，陜西 安康 725000)

巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseYing)始載于《神農本草經》，味苦、辛，性溫，歸肝、腎經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，臨床常用于治療小兒麻痹癥、神經衰弱、慢性氣管炎等，是藥用歷史悠久的傳統中藥之一[1-3]。巫山淫羊藿含多種成分，具有防抑郁、抗腫瘤、抗氧化和增強機體免疫力等功能，也具有抗皮膚老化、美白等功能[3]。巫山淫羊藿的有效活性成分淫羊藿苷和朝藿定C是目前市場急需的保健原料之一。但是巫山淫羊藿中的淫羊藿苷含量并不高，目前多采用大孔樹脂進行純化提高含量[4]。而巫山淫羊藿中藥材含有多種與淫羊藿苷結構類似的成分，理論上存在生物轉化為淫羊藿苷的可能性，與朝藿定C結構類似的化合物也有轉化為朝藿定C的可能。

生物酶能分解細胞壁中的纖維素、半纖維素及果膠，加快有效成分溶出，提高提取效率，同時作用于目標產物中立體結構大的活性成分。因此，使用葡萄糖苷酶、轉苷酶、淀粉酶等斷裂糖苷鍵，改變理化性質，提高效用[5-6]。酶解法高效，條件溫和，操作簡單，能更好提升產率更利于工業生產。纖維素酶、果膠酶和α-淀粉酶是目前酶解常用的酶，其中纖維素酶是一種復合酶，能夠降解纖維素及纖維素衍生物；果膠酶可以降解細胞間的果膠質,使細胞從組織內分離出來；α-淀粉酶可以斷裂淀粉內部的α-1,4-糖苷鍵[7-10]。

為探索一種綠色方法來提高巫山淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C的含量，達到綠色高效提取的目的，作者將酶解與大孔樹脂純化相結合，在巫山淫羊藿提取物中分別加入α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶進行酶解，經大孔樹脂純化后采用HPLC法測定巫山淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C含量；并初步研究巫山淫羊藿提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性[11]，為巫山淫羊藿有效成分的開發奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

巫山淫羊藿提取物，安康市寶杰植化有限公司。

淫羊藿苷標準品、朝藿定C標準品、α-淀粉酶，上海源葉生物科技有限公司；SCDLP液體培養基、卵磷脂吐溫80營養瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司；果膠酶、纖維素酶，河南美羅實業有限公司；乙腈、甲醇，山東禹王天下新材料有限公司；乙醇，天津天力化學試劑有限公司；AB-8大孔樹脂，天津光復精細化工研究所。

電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；KH-250DE型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；LRH-150型生化培養箱，海慧泰儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巫山淫羊藿提取物的酶解

稱取巫山淫羊藿提取物3份，每份5 g，分別置于燒杯中，按料液比1∶10(g∶mL)加入蒸餾水溶解；分別加入0.5%(以提取物溶液體積計)的α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶，超聲1 h后繼續保溫(50 ℃)酶解8 h，即得巫山淫羊藿黃酮，分別命名為α-淀粉酶酶解物、果膠酶酶解物、纖維素酶酶解物。

1.2.2 巫山淫羊藿提取物的純化

取AB-8大孔樹脂4份，每份50 g，分別置于燒杯中，加入95%乙醇浸泡2 h；分別裝柱，蒸餾水清洗至無醇味。將巫山淫羊藿提取物、α-淀粉酶酶解物、果膠酶酶解物、纖維素酶酶解物分別上柱吸附，蒸餾水洗至無色后用8 BV 75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮，于80 ℃烘箱中干燥6 h，分別得到巫山淫羊藿純化物、α-淀粉酶酶解純化物、果膠酶酶解純化物、纖維素酶酶解純化物。

1.2.3 HPLC法測定淫羊藿苷和朝藿定C的含量

1.2.3.1 混合標準溶液的制備

精密稱取1.0 mg淫羊藿苷標準品和朝藿定C標準品于10 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，混勻，配制成0.1 mg·mL-1的混合標準溶液。

1.2.3.2 供試溶液的制備

精密稱取巫山淫羊藿提取物或純化物0.2 g于錐形瓶中，用20 mL 50%乙醇溶解，稱重；超聲45 min，補足重量，混勻；取1.0 mL定容至10 mL容量瓶中，混勻，0.45 μm濾膜過濾，即得供試溶液。

1.2.3.3 色譜條件[12]

BP-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(25∶75，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長270 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.4 濾紙片法測定巫山淫羊藿提取物的抑菌活性

1.2.4.1 樣品溶液的制備

稱取40 mg巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物、果膠酶酶解純化物，分別置于4個燒杯中，配制成10 mg·mL-1溶液；取直徑1 cm的圓形濾紙片放入上述溶液中浸泡2 h，備用。

1.2.4.2 固體培養基的制備

稱取卵磷脂吐溫80營養瓊脂2.55 g于玻璃瓶中，加入50 mL蒸餾水溶解，封瓶；沸水中加熱溶解至無沉淀，冷卻后倒入培養皿中，于超凈工作臺凝固24 h，備用。

1.2.4.3 抑菌實驗

稱取SCDLP液體培養基2.28 g于玻璃瓶中，加入60 mL蒸餾水溶解，封瓶；沸水中加熱溶解至無沉淀，冷卻后倒入培養管中；用移液管取金黃色葡萄球菌或大腸桿菌各1 mL至培養管中，于保溫箱中保溫24 h；取出，用移液管取0.5 mL至固體培養基上，用涂布器涂抹均勻，再將浸泡2 h的圓形濾紙片放在上面，蓋上培養皿蓋子，置于培養箱中培養4 h。

2 結果與討論

2.1 HPLC圖譜

混合標準溶液和供試溶液在色譜條件下的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 混合標準溶液(a)和供試溶液(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of complexed standard solution(a) and test solution(b)

由圖1可知，在色譜條件下，樣品各成分分離良好，理論板數按朝藿定C色譜峰計算不低于2 000。

2.2 線性關系

制備濃度分別為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1、100 μg·mL-1的標準溶液，在色譜條件下進樣測定。以標準溶液濃度(c， μg·mL-1)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得到淫羊藿苷標準曲線方程為A=14296c-46141，R=0.9994，線性范圍0.02～0.1 mg·mL-1；朝藿定C標準曲線方程為A=11355c-17916，R=0.9993，線性范圍0.02～0.1 mg·mL-1。

2.3 精密度實驗

按1∶1配制50 μg·mL-1的混合標準溶液，在色譜條件下連續進樣6次，測定峰面積，計算得到淫羊藿苷和朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.74%、1.77%。表明，儀器精密度良好。

2.4 重現性實驗

取同一批次的巫山淫羊藿提取物，按1.2.3.2方法制備供試溶液，平行制備6份，在色譜條件下進樣，測定峰面積，計算得到淫羊藿苷和朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.35%、1.65%。表明，該方法重現性良好。

2.5 穩定性實驗

取同一份供試溶液，在室溫、色譜條件下進樣，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h測定峰面積，計算得到淫羊藿苷和朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.71%、1.24%。表明，供試溶液在24 h內穩定。

2.6 加標回收率實驗

取已知含量的巫山淫羊藿提取物6份，分別加入一定量的淫羊藿苷標準品和朝藿定C標準品，制備供試溶液，在色譜條件下進樣測定，計算加標回收率及RSD值，結果見表1。

表1 加標回收率實驗結果

由表1可知，淫羊藿苷和朝藿定C的加標回收率的RSD值分別為1.09%、2.19%。表明該方法的準確度較好，可用于淫羊藿苷和朝藿定C的含量測定。

2.7 樣品測定

分別稱取巫山淫羊藿提取物、α-淀粉酶酶解純化物、果膠酶酶解純化物、纖維素酶酶解純化物，按1.2.3.2方法制備供試溶液，在色譜條件下進樣測定，依據標準曲線方程計算淫羊藿苷和朝藿定C的含量，結果見表2。

表2 巫山淫羊藿提取物及其酶解純化物中淫羊藿苷和朝藿定C的含量/%

由表2可知，巫山淫羊藿提取物在經過酶解和大孔樹脂純化后，淫羊藿苷和朝藿定C的含量均明顯增加，其中果膠酶對兩者含量的影響最大，巫山淫羊藿提取物在經過果膠酶酶解和大孔樹脂純化后，淫羊藿苷含量為11.65%，朝藿定C含量為31.79%。

2.8 抑菌活性

巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物、果膠酶酶解純化物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌實驗結果如圖2所示。

(a)金黃色葡萄球菌 (b)大腸桿菌

由圖2可知，巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物、果膠酶酶解純化物對金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌效果，其中巫山淫羊藿提取物的抑菌效果最強(圖2a)；果膠酶酶解純化物對大腸桿菌的抑菌效果不明顯，巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物對大腸桿菌有一定的抑菌效果(圖2b)。總體來看，未酶解的巫山淫羊藿提取物的抑菌活性優于酶解物和純化物。

3 結論

巫山淫羊藿提取物在經過酶解和大孔樹脂純化后，淫羊藿苷和朝藿定C的含量均明顯增加，其中果膠酶對兩者含量的影響最大，巫山淫羊藿提取物在經過果膠酶酶解和大孔樹脂純化后，淫羊藿苷含量為11.65%，朝藿定C含量為31.79%。巫山淫羊藿提取物及果膠酶酶解物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較好的抑菌效果，但未酶解的巫山淫羊藿提取物的抑菌活性優于酶解物和純化物，原因有待進一步深入研究。