2014年至2020年佳木斯市流感病毒分離結果分析

劉莉 包名家 王彬 劉丹丹 馬永娟 張維娜

佳木斯市疾病預防控制中心 154007

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的具有高度傳染性的急性呼吸道傳染病。由于流感病毒基因的高度變異性，人群對其普遍易感，易造成人群反復感染、發病率高，可在世界范圍內廣泛流行。

流感的病原學監測是流感監測的重要內容，病毒分離培養是病原學監測的基礎［1］，是流感病毒監測最常用和最可靠的方法之一。佳木斯市疾病預防控制中心流感監測網絡實驗室通過實時熒光聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法對流感樣病例標本進行核酸檢測，陽性標本接種MDCK 細胞（Madin-Darby Canine Kidney cells，狗腎細胞）和SPF（specific pathogen free，無特定病原體）雞胚雙腔進行病毒分離。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集 樣本來自佳木斯市兩家流感監測哨點醫院（佳木斯市中心醫院和佳木斯大學附屬第一醫院）。樣本送到實驗室后存放至4 ℃冰箱保存，如未及時檢測存放于-70 ℃保存待用。核酸檢測流感病毒陽性標本最好在24 h 內利用狀態良好的MDCK 細胞或SPF 雞胚進行病毒分離。

1.2 實驗材料 SPF 雞胚和MDCK 細胞由黑龍江省疾病預防控制中心提供，TPCK 胰酶，DMEM 培養基（貨號：AE29005267）、胎牛血清（貨號：1841924）等細胞培養試劑均為美國GIBCO 公司產品；ABI 7500 型熒光定量PCR 儀為美國AB 公司產品；核酸提取試劑RNeasy Mini Kit（貨號：SDKF60101D）為江蘇碩世公司產品。流感病毒標準參考血清和參考抗原由國家流感中心配發，人O 型血紅細胞來源于本中心工作人員，使用濃度為1%。

1.3 MDCK 細胞接種 核酸檢測陽性樣本用0.22 μm的過濾器過濾后接種到已經清洗的75%～90%生長良好的成片細胞中，放入5%CO2培養箱中吸附1～2 h，從培養箱中取出細胞培養瓶用PBS緩沖液清洗細胞3次，加入5 ml含終濃度為2 μg/ml TPCK 胰酶的病毒生長液于細胞培養瓶中，置于35 ℃5%CO2培養箱中培養。

1.4 雞胚接種 按常規雞胚雙腔培養法，取9～11 日齡SPF 雞胚接種，3 胚蛋/標本，置于35 ℃孵箱孵育72 h 后，置-20 ℃冰箱1～2 h，按常規分別收獲尿囊液和羊水。

1.5 分離物鑒定 細胞培養物的收獲，當75%～100%細胞出現病變時進行收獲，雞胚收獲尿囊液和羊水。培養物收獲后采用紅細胞凝集試驗（HA）和紅細胞凝集抑制試驗（HI）方法進行病毒型別鑒定。HA 滴度達到8 及以上時，直接進行HI 試驗；若HA 滴度小于8 則對培養物進行10-1～10-3稀釋后，繼續進行病毒傳代培養，直到HA 滴度大于等于8。

1.6 統計學處理 數據來源于中國疾病預防控制系統流感監測信息平臺，數據信息錄入Excel 2007，應用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析，計數資料用例（百分比）表示，采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 病毒分離情況 2014.4.1—2020.3.31 流感病毒核酸檢測陽性數為811 份。6 個監測年中MDCK 細胞培養法分離流感病毒，每個年份之間分離率差異有統計學意義（χ2=64.640，P＜0.01）；分離率高的年份為2015.4.1—2016.3.31，分離率為60.00%；分離率最低的年份為2019.4.1—2020.3.31，分離率為23.12%。雞胚雙腔培養法分離流感病毒，各年監測中分離率差異有統計意義（χ2=18.429，P＜0.01），2014.4.1—2015.3.31 分離率為0%，2019.4.1—2020.3.31分離率最高，為33.87%。MDCK細胞培養法分離流感病毒總分離率為40.69%，雞胚雙腔培養法總分離率為21.30%，兩種培養流感病毒的方法分離率之間差異有統計學意義（χ2=48.343，P＜0.01），MDCK 細胞培養法分離率優于雞胚雙腔培養法。見表1。

表1 MDCK細胞培養法和雞胚雙腔培養法分離流感病毒情況

2.2 亞型分布情況 MDCK 細胞培養法分離流感毒株330 株，其中甲型H1N1 108 株、甲型H3N2 122 株、乙型BV 57 株、乙型BY 43 株；雞胚雙腔培養法分離流感毒株95 株，其中甲型H1N1 59 株、甲型H3N2 0 株、乙型BV 19 株、乙型BY 17株。見表2。

表2 MDCK細胞培養法和雞胚雙腔培養法分離流感毒株亞型情況（株）

2.3 血凝效價情況 雞胚雙腔培養法分離出流感毒株95 株，對應樣本MDCK 細胞培養法全部分離出流感病毒，并且病毒血凝效價滴度16 共9 株，≥32 共86 株。見表3。

表3 雞胚雙腔培養法毒株對應樣本MDCK細胞培養法分離毒株血凝滴度情況

2.4 毒株代數情況 MDCK 細胞培養法分離流感毒株330 株，二次傳代培養分離出毒株數最多185 株，四次傳代培養分離毒株數最少8 株；雞胚雙腔培養法分離出毒株95 株，二次傳代培養分離出毒株最多為70 株，一次傳代培養分離出毒株數最少6 株。從表4 可以看出，MDCK 細胞培養法和雞胚雙腔培養法都是二次傳代分離毒株數多。

表4 MDCK細胞培養法和雞胚雙腔培養法分離流感病毒毒株代數情況

3 討 論

病毒分離和鑒定是診斷病毒感染的“金標準”，對監測流行病的新動向、研究新疾病、新病毒以及新病毒與疾病的關系都有重要作用。目前多采用MDCK 細胞培養法和雞胚雙腔培養法進行流感病毒分離。佳木斯市MDCK 細胞培養法分離流感病毒各年份之間分離率差異有統計學意義（χ2=64.640，P＜0.01）。2015.4.1—2016.3.31 分離率 最高為60.00%，流行的型別以乙型BV 為主（55 株），甲型H3N2 為輔（29 株）（表2）。而2019.4.1—2020.3.31 分離率最低，為23.12%，分離率低的原因可能與2019 年末流行新型冠狀病毒有關，流感就診患者量減少，年后居家隔離，流動性減少有關。雞胚雙腔培養法分離率最高的年份為2019.4.1—2020.3.31，為33.87%。推測疫情原因，核酸檢測陽性率低，接種樣本量減少，但毒株陽性率不低，均為甲型H1N1亞型，甲型H1N1 亞型對雞胚很敏感，楊式芹等［2］報道甲型H1N1 流感病毒對雞胚培養的分離率高于其他季節性流感病毒，這也可能是分離率高的原因。MDCK 細胞培養法和雞胚雙腔培養法分離率之間差異有統計學意義（χ2=48.343，P＜0.01），MDCK 細胞培養法分離率優于雞胚雙腔培養法分離率，這與劉建軍等［3］報道MDCK 細胞培養法分離流感病毒比雞胚雙腔培養法敏感報道相符。雞胚雙腔培養法分離出毒株的樣本對應的MDCK 細胞培養法全部分離出毒株，并且MDCK 細胞培養法滴度多數≥32（表3），推測MDCK細胞培養法血凝滴度≥32的樣本接種到雞胚雙腔中，更容易分離出流感病毒，這為以后提高雞胚雙腔法流感病毒分離率提供參考依據。

1998 年以后的甲型H3N2 亞型病毒的分離多采用MDCK 細胞培養法［4］。病毒的相變異導致甲型H3N2 亞型僅對MDCK細胞敏感，使雞胚雙腔法分離甲型H3N2亞型的陽性率極低［5-7］，所以本實驗中為了提高流感病毒的分離率，我們用雞胚雙腔法接種樣本時，沒有選擇核酸陽性的甲型H3N2亞型的樣本。乙型毒株則對兩種宿主系統都敏感，因此必須同時使用雞胚雙腔和MDCK 細胞兩種宿主系統分離流感病毒。MDCK 細胞培養法分離流感病毒可以保證病毒抗原性與原始毒株相近，且可以長時間保存。

MDCK細胞培養的是活的病毒株，所以流感病毒標本在采集、運輸保存過程中應注意不要被滅活，另外MDCK 細胞的代數和敏感度與流感病毒分離有很大關系［8］。本實驗中兩種培養法分離流感病毒均在二次傳代分離毒株數高，MDCK細胞培養法二次傳代毒株構成比為56.06%（185/330），雞胚雙腔培養法二次傳代毒株構成比為73.68%（70/95）（表4）。從省級實驗室取回20 代左右的MDCK 細胞后，及時培養，凍存低代數的細胞。當MDCK 細胞傳代數接近30 代時候，復蘇凍存的MDCK細胞，以保障提高細胞對病毒的敏感性。

目前中醫藥防治的整體觀，是預防、控制、治療流感的嶄新思路。通過藥物、飲食、調息等多種療法，輔助正氣、補虛瀉實、調和陰陽，提高抗病能力［9］，但流感疫苗是目前預防流感最有效的手段。流感疫苗仍然來自雞胚分離株，我們需要從雞胚株中篩選代表株為疫苗推薦提供候選毒株，但是近來流行的甲型H3N2 亞型流感病毒很難在雞胚中擴增，并且在雞胚中病毒產生的適應性突變能造成毒株抗原性的改變，因而目前推薦合適的甲型H3N2疫苗組分也是世界衛生組織遇到的挑戰［7］，SPF 雞胚雙腔法分離病毒，其主要困難在于雞胚的來源不穩定、個體差異大、供貨周期長和運輸成本高等問題，且接種方法對實驗人員技術要求較高，故多數實驗室該法病毒分離率一直較低［10］。為了提高流感病毒分離率，實驗室一直在摸索提高病毒分離率的方法，為流感防控提供科學依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。