大白母豬發情期前后唾液蛋白組學分析

李晨雷 齊昆龍 劉鎣珂 葉建偉 李新建 王克君 李秀領 喬瑞敏 韓雪蕾

(河南農業大學 動物科技學院，鄭州 450046)

在豬生產過程中，發情鑒定的準確性是影響母豬繁殖性能的重要因素。目前采用的發情鑒定法如外部觀察法、壓背反應法和公豬試情法有工作量大、準確率低等缺點，有些異常發情如安靜發情、短促發情、持續發情等情形很難把握配種時機，易造成鑒定準確度不高、異常發情判斷不準和重復配種資源浪費的現象[1]，與此同時各類家畜新型發情鑒定法的研究也從未停止，唾液[2]、血液[3]、尿液[4]等各種體液中差異表達的生物分子已成為診斷母畜發情的重要標靶。

唾液主要由腮腺、舌下腺和下頜腺三對唾液腺及口腔黏膜下大量小唾液腺分泌物組成，主要有水和一些非蛋白類有機物(如尿酸、膽紅素、肌酸酐、葡萄糖、脂肪酸等)及一些蛋白類或多肽類物質(如α-淀粉酶、白蛋白、分泌型免疫球蛋白A、富酪蛋白等)，另外，還含有一些激素(如皮質醇、睪酮、黃體激素、雌二醇、醛固酮等)和核酸物質(如miRNA)等[5-6]，人體內絕大多數的代謝產物、激素和抗體等可經過血液的被動擴散、主動轉運等方式進入唾液，唾液的成分復雜而且相對穩定。唾液是動物體內重要且必需的體液，唾液中含有豐富的類固醇激素、DNA等，并含有高分子敏感度的RNA、氧化應激標志物等成分，近年來，除了血漿、血清和尿液外，唾液已成為檢測人類和動物生理、病理狀態的有效工具[7]。研究發現，人的唾液中含有2 000多種不同的蛋白，以及2 000多種低分子量的多肽片段，占分泌蛋白比重的40%～50%[8]，唾液與血液重疊部分蛋白質含量約為27%，有40%的蛋白質作為腫瘤、心血管疾病等的候選標志物被發掘，在上個世紀以前，唾液已被人類用于檢測疾病和健康評估，呂磊等[9]采用酶聯免疫法發現婦女唾液和血液中的E2含量成正比，且與卵泡大小和數目呈顯著相關，因此可通過檢測唾液E2含量側面反映血漿游離激素水平，用于臨床實踐。Lindsay等[10]研究證實唾液是準確的臨床指標，可以用來衡量游離型激素的含量并診斷HPA軸的功能不佳。目前唾液檢測在動物中的應用，主要在豬病檢測方面，包括PRRSV、豬流感病毒、豬口蹄疫病毒、豬圓環病毒2型和豬瘟病毒等病原體的抗原抗體檢測[11-15]。近年來，諸多研究證實，唾液和血液中的激素、藥物、抗體、病毒等的含量具有較高的相似度[16-22]。唾液采集相對于傳統的血液采集具有明顯的優勢，具有簡便性、無創性、樣本易于儲存和運輸等特點，同時在進行唾液采集時，動物處于主導地位，與被動性的采血相比較能更真實的反映動物機體的狀態，可明顯減少動物的應激反應[23]。唾液檢測是無創檢測領域的一個熱點，具有很大的發展潛力和應用前景，目前通過唾液蛋白標記物對母豬進行發情鑒定還未見報道。

因此，本研究通過對大白母豬發情周期不同階段的唾液樣品進行蛋白組學測序和分析，以揭示發情母豬唾液中蛋白質水平變化規律，篩選與發情相關的唾液蛋白，為母豬準確發情鑒定提供重要參考，并為下一步母豬發情鑒定試劑盒/試紙條的開發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

選取4頭三胎經產大白母豬，豬舍類型為全封閉豬舍，大圈飼養模式，每圈8～10頭母豬，豬舍內溫度控制在15～22 ℃，濕度保持在45%～60%，飼養環境適宜，繁殖機能正常，健康無遺傳疾病。發情鑒定采用外部觀察法和壓背反應法綜合鑒定母豬發情，在試驗期間每天早上、中午和晚上分別對實驗母豬進行觀察，每次觀察30 min，當母豬出現躁動不安，食欲減退，陰部充血、腫脹并有粘液分泌和爬跨其他豬等行為時，在豬鼻上噴灑公豬氣味劑并用力按壓背部，母豬靜立不動并弓背豎耳即鑒定為發情，發情日當天記為第0天。采用咀嚼式方法對發情前后生殖激素含量變化明顯的3個階段進行唾液采集[24]，包括發情前期(PE/Proestrus)：發情前3天，發情期(E/Estrus)：發情當天和發情后期(AE/After estrus)：發情后3天。唾液采集時間為每天早上飼喂前(早6：00—早7：30)，4 ℃，4 000 g低溫離心后收集上清液，置于-80 ℃冰箱中保存備用，供后續使用Lable-free定量蛋白組學技術進行唾液蛋白組測序。

1.2 樣品消化和酶水解

分別采集4頭經產母豬3個階段的唾液，按不同階段分別轉移至3 ku超濾管，4 ℃ 7 000 g離心濃縮，加入1 mL 25 mmol /L ABC,4 ℃ 7 000 g 30 min 離心3次，每次吸取濾膜上層保留的液體(約100 μL)。每份樣本加100 μL SDT裂解液，100 ℃ 金屬浴3 min，離心取上清。于-80 ℃中取出樣本蛋白質裂解液，凍融，取1 μL進行BCA法定量。根據定量結果取20 μg蛋白質樣本進行SDS-PAGE電泳。取各樣品300 μg進行FASP酶解。樣品加入200 μL UA buffer(8 mol Urea，150 mmol Tris-HCl pH 8.5)混合搖勻，在室溫下14 000 g離心30 min，棄濾液，此步驟重復3次。加100 μL IAA(50 mmol IAA in UA)，600 r/min 振蕩1 min，室溫避光300 r/min 孵育30 min，14 000 g 室溫離心30 min。加入100 μL UA buffer后室溫14 000 g離心30 min，重復3次。然后加100 μL 25 mmol/L ABC，相同條件離心，重復3次。濾出液棄置后加入40 μL Trypsin buffer(2 μg Trypsin in 40 μL 100 mmol/L ABC)，放置恒溫混勻儀上(300 r/min，18 h，37 ℃)。室溫14 000 g離心30 min，收集濾出液并換新收集管后加入40 μL 100 mmol/L ABC，室溫14 000 g離心30 min，取濾液，OD280肽段定量。

1.3 質譜分析

樣品酶解后進行毛細管高效液相色譜脫鹽以及分離，之后使用Orbitrap-Elite 質譜儀進行質譜分析。使用自動進樣器，以150 nL/min的流速將每個樣品共1 μg上到Thermo Scientific EASY柱(兩柱)上。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照每次全掃描后采集10個碎片圖譜(MS2 scan)的方法采集，MS2 Activation Type:CID，Isolation window：1 m/z，質譜儀在正離子模式下運行，母離子掃描范圍為300～2 000 m/z。Orbitrap Elite在200 m/z的一級質譜和二級質譜掃描分辨率分別設置為60 000 at m/z和15 000 at m/z。選取獲得的質譜中最強烈的10個信號進行進一步的分析。

1.4 數據庫檢索、蛋白質鑒定與定量

LC-MS/MS質譜檢測使用的系統為ABSCIEX Triple TOFTM 5 600 plus質譜系統，AB SCIEX分析柱，使用標準化的質譜數據流程進行分析。

對于鑒定到的蛋白質，蛋白鑒定分值(Unused score)≥1.3(即可信度水平在95%以上)且每個蛋白至少包含一個唯一肽段的蛋白定義為可信蛋白。按照LFQ值對蛋白進行Fold Change(FC)計算，利用Persus軟件(Version1.4.1.3，http:∥www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:start)中Significant A算法對FC進行顯著性參數PValue計算。

使用Maxquant軟件進行分析，將質譜數據由譜峰形式轉化為直觀的雙向凝膠圖譜，圖上每一個點代表一個肽段，通過比較不同樣本上相應肽段的強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量，選擇肽匹配圖譜(PSM)FDR<0.01和肽段 FDR<0.01進行篩選[25]。

1.5 數據分析

對鑒定到的蛋白質通過LFQ值進行Fold change(FC)計算、P Value計算，并且按照表達倍數上調≥1.5且P<0.05進行篩選，使用Uniprot蛋白數據庫(www.Uniprot.com)進行分析，并設置3個比較組：E vs AE、E vs PE和AE vs PE。將篩選出來的差異蛋白進行Gene Ontology (GO)功能注釋和KEGG 信號通路分析，篩選差異蛋白富集的GO功能和KEGG信號通路，并利用 String數據庫(http:∥string.embl.de/)和Cytoscape(http:∥www.cytoscape.org/)軟件對差異蛋白進行網絡互作分析[26]。

2 結果與分析

2.1 大白母豬發情周期唾液蛋白質鑒定

通過對發情周期3個階段的唾液蛋白組數據進行分析，分別得到2 205、1 918和2 104個肽段，共鑒定出405個蛋白，其中PE、E和AE分別有290、191和318個蛋白質(表1)，分子量分布主要在 10～20 ku、20～30 ku、30～40 ku、40～50 ku、50～60 ku的范圍內，占總蛋白的73.43%，其中有78.27% 被鑒定的蛋白有3個及以上的肽段(圖1(a)和(b))。對鑒定到的405個唾液蛋白進行蛋白聚類分析，其中PE、E和AE 3個階段共有蛋白數量為149個，PE和E，PE和AE，E和AE階段共有蛋白的數量分別為8、79和9個，PE、E和AE分別有54、25和81個特異蛋白(圖2和3)。

(a)不同分子量的肽段數量；(b)可識別不同肽段的蛋白質數量(a)The number of peptides with different molecular weight;(b)The number of proteins recognizing different peptides圖1 發情周期唾液蛋白質鑒定與分析Fig.1 Identification and analysis of salivary proteins during the estrus cycle

圖2 發情周期唾液蛋白聚類熱圖Fig.2 Heat map of salivary protein clustering during estrus cycle

圖3 發情周期唾液蛋白鑒定韋恩圖Fig.3 Quantitative Wayne diagram of salivary protein during estrus cycle

表1 發情周期不同階段唾液蛋白統計與分析Table 1 Statistics and analysis of salivary protein in different stages of estrous cycle

2.2 大白母豬發情周期唾液差異蛋白的篩選與分析

對鑒定到的蛋白質進行差異顯著性分析，共得到45個差異蛋白質，如圖4所示，在E vs PE 組，有18個蛋白差異達到顯著水平，包括6個上調和12個下調蛋白(P<0.05)；E vs AE組，有17個差異顯著蛋白，包括8個上調和9個下調蛋白(P<0.05)；在PE vs AE組中，共有10個蛋白差異達到顯著水平，其中包括9個上調和1個下調蛋白(P<0.05)。

圖4 發情周期唾液差異蛋白聚類熱圖Fig.4 Heat map of salivary differential proteins in estrus cycle

2.3 大白母豬發情周期唾液差異蛋白GO和KEGG富集分析

對篩選出的45個差異顯著蛋白進行GO和KEGG富集分析，結果顯示，其參與富集顯著的GO條目主要涉及分子功能和細胞過程，包括小分子結合、急性時相反應、內肽酶活性的負調控、DNA損傷后內源性凋亡信號通路的負調控等；參與的細胞組分有胞外區，胞外區包含垂體促性腺激素復合物等(P<0.05)，KEGG通路主要包括胰高血糖素信號通路、丙酸代謝、丙酮酸代謝、長時程增強效應和光轉導等(P<0.05)，結果如表2和3所示。

表2 發情周期唾液差異蛋白GO富集分析Table 2 Go enrichment analysis of salivary differential protein during estrus cycle

表2(續)

表2(續)

2.4 蛋白質互作(PPI)網絡分析

為進一步揭示篩選到的差異蛋白功能，利用Cytoscape軟件對富集的差異和特異蛋白進行蛋白互作分析，結果如圖5所示，F1SFI7與P79263、Q29549、F1SS24、Q9GMA6，Q9GMA6與Q2EN74、Q29549、F1SS24，F1SS24與Q29549間均存在互作關系，其中F1SFI7和 Q9GMA6蛋白間互作最強。

3 討 論

母豬發情周期除受到溫度、光照和營養水平等外因的影響外，也與神經系統和內分泌系統等內因密切相關。眾所周知，雌激素、孕激素、促黃體生成素、促卵泡素等均與發情有關。激素在體內通常以與受體蛋白結合的形式發揮作用。在發情周期的不同階段，參與激素調控的蛋白不同，在生物體中，蛋白質并不是獨立存在的，不同蛋白質通過彼此間相互作用共同行使功能，因此對激素相關蛋白質間互作及其調控網絡的研究，對于揭示發情周期調節機理具有重要意義。本研究通過對大白母豬發情周期前后唾液蛋白組進行測序和分析，共篩選到45個顯著差異蛋白和160個特異蛋白，通過功能注釋與分析篩選出F1SFI7、P79263、Q29549、F1SS24、Q9GMA6、Q2EN74和P00336 7個潛在的與發情過程密切相關的唾液激素蛋白，其中Q9GMA6和F1SS24為PE期的特異蛋白質，Q2EN74為E期的特異蛋白質，F1SFI7、P00336和Q29549為E期顯著上調的差異蛋白，P79263為PE期顯著上調的差異蛋白。

α-2-HS-糖蛋白(F1SFI7)，別名胎球蛋白由AHSG編碼，它的主要功能是參與骨穩態的調節。在Qiu等[27]的研究中指出雌激素通過與c-Jun/c-Fos異二聚體間接結合ERα與-1488/-1482 AP-1結合元件激活AHSG的轉錄；Eichner等[28]研究了不同等位基因AHSG對定量雌激素、雌酮和雌二醇的影響，結果表明AHSG的2個主要等位基因導致3種表型，不同表型導致不同的雌二醇和雌酮含量，這些研究表明AHSG與雌激素濃度顯著相關。簇蛋白(Q29549)由CLU編碼，它的主要功能是作為細胞外伴侶，防止非天然蛋白質聚集。Cappelletti等[29]和Toffanin等[30]研究證明CLU的沉默或下調可以使乳腺癌細胞恢復對托瑞米芬(抗雌激素)的敏感性，雌激素受體做為一種蛋白質分子，比較多的存在于靶器官的細胞內，如卵巢和子宮，雌激素與雌激素受體發生特異性結合，進而使雌激素發揮其生物學效應，蛋白互作分析顯示AHSG和CLU間存在互作關系，蛋白定量結果表明其表達模式也相同，均在E期顯著性上調(P<0.05)，推測AHSG和CLU相互作用影響雌激素濃度或雌激素受體的敏感性。鈣調蛋白(F2Z5G3)由STPG4編碼，其與鈣介導的信號轉導有關，在Lu等[31]研究中指出，F2Z5G3是cAMP信號通路和鈣離子信號通路的信號分子，其下調會抑制P4(孕酮)的分泌，同時上調雌二醇的合成，雌二醇與孕酮是由卵巢、胎盤與腎上腺分泌的激素，在特定生理階段具有拮抗作用，因此推測F2Z5G3可能通過cAMP信號通路調控雌二醇和孕酮的表達從而影響發情表現。

抗胰凝乳蛋白酶(Q9GMA6)由SERINA3-2編碼，SERPINs(絲氨酸蛋白酶抑制劑家族)參與調節蛋白酶的活性，賈銀海等[32]和Fu等[33]研究表明SERPINs家族中的SERPINA14和SERPINA3-1等參與調節卵泡細胞外基質的重塑和卵泡的發育，因此,推測SERPINA3-2可能與卵泡的發育有關。α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(P79263)由ITIH4編碼，它的主要功能是參與創傷后炎癥反應，Patil等[34]研究團隊在對多囊卵巢綜合征(PCOS)的蛋白組學研究中發現，ITIH4在多囊卵巢綜合征患者的卵泡液中呈顯著下調趨勢，其在血管生成和細胞外基質穩定中起作用，對卵泡成熟至關重要。本研究蛋白互作分析結果顯示ITIH4和SERINA家族與AHSG之間存在互作關系，并且SERINA家族和AHSG之間相互作用關系最強，前者影響卵泡發育，后者與雌激素濃度顯著相關，蛋白定量結果表明SERPINA3-2為PE期的特異蛋白質，ITIH4在PE期顯著性上調并且AHSG在E期顯著上調(P<0.05)，因此，推測這些蛋白在卵泡發育過程中可能通過影響雌激素合成從而影響母豬的發情。乳酸脫氫酶(P00336)由LDHB編碼，其主要功能是將丙酮酸發酵為乳酸，除了已被證實在調節糖酵解方面有作用以外，Marianna等[35]通過對子宮內膜異位癥患者的卵泡液代謝組學分析發現LDHB的表達與卵母細胞質量有關，Poulsen等[36]對人體排卵過程中卵泡液成分蛋白組學定量分析發現LDHB在整個排卵期的表達具有顯著變化，并在排卵12～17 h后達到高峰，蛋白定量結果表明LDHB在E期顯著上調(P<0.05)，這與Poulsen等的研究相符。卵泡液主要由卵泡細胞分泌，促卵泡激素可直接促進竇前卵泡和竇狀卵泡顆粒細胞的增殖與分化，使卵泡液分泌增加進而維持卵泡的生長發育。在卵泡發育過程中，促卵泡素和促黃體生成素發揮重要作用，其中促黃體生成素可以促進雄激素分泌，雄激素可為雌激素的合成提供底物，促進卵母細胞的排出，因此推測LDHB與促黃體素和雌激素的生成有關，從而影響發情。

綜上所述，通過對發情周期不同階段唾液蛋白進行分析，其中AHSG、CLU和LDHB在E期顯著性上調，SERPINA3-2為PE期的特異蛋白并且ITIH4在PE期顯著上調，推測AHSG和CLU相互作用影響雌激素生成或雌激素受體的敏感性，LDHB與促黃體素和雌激素的生成有關，ITIH4和SERPINA3-2可通過影響卵泡的發育和成熟從而調控發情，還需要后續試驗驗證，下一步將針對篩選出的候選蛋白進行抗原抗體制備和配對檢測，ELISA試劑盒檢測方法構建，試紙條檢測和分析等實驗，對篩選到的蛋白進行驗證，為開發發情鑒定試劑盒并在生產中推廣和應用打下堅實的基礎。

4 結 論

本研究采用Lable-free定量蛋白組學技術對經產大白母豬發情期及發情前后3個階段的唾液蛋白組進行測序與分析，篩選到F1SFI7、Q29549、Q2EN74、Q9GMA6、P00336、P79263和F2Z5G3 7個蛋白作為指示發情的潛在候選蛋白，為下一步發情鑒定試劑盒/試紙條的開發提供借鑒。