針灸實驗中非麻醉狀態下鼠科動物固定方法應用國內外進展

姜珊,蔣廣威,尹磊淼,2,徐玉東,2,陳艷焦,2,楊永清,2,王宇,2

（1.上海中醫藥大學,上海 201203;2.上海市針灸經絡研究所,上海 200030）

針灸實驗研究多以鼠科動物為實驗對象,為便于針灸操作,多采用在非麻醉狀態下固定實驗動物。目前針灸研究中采用的動物固定方法包括束縛固定[1]、置高臺固定[2]、懸吊固定[3]。以上固定方法分別與束縛應激（捆綁）、恐高應激（置高臺）和失重應激（懸吊）相關。因不同固定方法均會產生不同程度的應激反應,影響實驗動物生理、病理指標,從而影響針灸療效的準確評估。筆者通過分析國內外針灸實驗中不同固定方法對針灸效應的干預,為選擇恰當的動物固定方法提供建議,以達到對針灸效應最小干預的目的,現報道如下。

1 固定應激及其對動物生理、病理的影響

1.1 應激

應激是機體在受到各種強烈刺激時所產生的全身性的非特異適應性綜合反應,表現為交感神經-腎上腺髓質（sympathetic-adrenomedullar, SSA）系統和下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸（hypothalamo-pituitaryadrenocortical, HPA）系統的活化,并伴有多系統組織和器官功能紊亂[4]。針刺效應與SSA和HPA系統密切相關,可有效干預中樞和外周HPA的各環節,可明顯降低 HPA軸相關激素促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）、皮質醇（corticosterone, CORT）、促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）水平[5-6]。因此,應激效應與針刺效應疊加,將影響對針刺效應的準確評判。

1.2 導致應激的外部因素

應激源作用于機體產生應激[7]。動物固定是針灸實驗研究中誘發實驗動物應激的主要應激源之一,包括捆綁束縛固定[1]、固定器束縛固定[8-9]、網罩束縛固定[10]、徒手固定[11]、懸吊固定[3]以及置高臺固定[12]等。

其中捆綁束縛固定、固定器束縛固定、網罩束縛固定、徒手固定屬于外力固定,可產生不同程度的束縛應激;置高臺固定產生恐高應激;懸吊固定產生失重應激。

1.3 應激對機體的影響

在應激狀態下,機體的多種穩態平衡被打破[13]。因應激程度、方式不同,可使機體產生生理性應激反應和病理性應激反應,即良性反應（適度應激）和不良反應（過度應激）。

研究表明束縛應激的實施時間與應激強度相關。單次刺激時間、頻率、強度所致累積刺激量決定應激程度。實驗研究中,慢性應激多見單次刺激0.5～6 h[14-16],反復刺激7～24 d[15-17];制備急性應激模型多見單次刺激 3～6 h,重復 1～5 d[18-20]。提示即使采取強刺激,但時程小,也不會對動物產生較大生理影響。對應激程度的評價指標可分為短效指標、長效指標和疾病指標。

1.3.1 束縛應激對機體的影響

束縛應激對機體產生較大干預。其中捆綁束縛、徒手固定對機體的影響最大,固定器固定、網罩束縛次之。捆綁束縛[21]通過繩索固定四肢、軀干,使動物處于強迫體位,活動度小,反抗激烈,應激反應大;固定器束縛可以調節肢體活動部位到合適位置,多采用鼠套[22]、布袋[23]等網罩類束縛方法,可使鼠類處于較自然狀態,可減小動物強烈反抗程度,應激相對較小[24]。

目前針灸實驗研究多采用捆綁束縛固定方法。研究提示,捆綁束縛固定應激可誘發鼠科整體行為認知、內分泌系統、自主神經系統生理指標改變,以及消化系統器質性病變。單次6 h、重復7～21 d慢性捆綁束縛固定應激可使鼠類出現焦慮樣行為、體質量增長減慢;慢性不可預測捆綁束縛性應激則會使鼠類患抑郁癥[15],糖皮質激素及其受體表達增加[25]。單次 2～4 h長期捆綁束縛應激,可激活HPA軸和自主神經系統[26]。單次6 h捆綁束縛冷應激可致鼠類患急性胃潰瘍性疾病[20,27]。

固定器束縛應激會造成鼠科整體行為認知、內分泌系統、神經系統的生理病理改變及心血管系統和消化系統的器質性病變。研究表明,單次 2.5 h、重復7～14 d固定器束縛應激,可致鼠類認知障礙和海馬神經元樹突棘缺失[17]。單次0.5 h、9 d的固定器束縛固定,會造成大鼠體質量增幅、痛閾和應激效應相關激素含量明顯降低,激活HPA軸,產生慢性應激效應[14]。固定器束縛應激可致大鼠肝臟中過氧化物酶體增殖物激活型受體α（PPAR-α）及其靶基因肝型肉堿棕櫚酰轉移酶-I（L-CPT-I）mRNA 表達增加,但研究表明 PPAR α及其 L-CPT-I表達的影響與固定器束縛應激本身有關,與應激時間長短關系不明顯[28]。單次 6 h、1～21 d固定器束縛應激可導致腦源性神經營養因子 mRNA總量和第四外顯子水平下降[29]。單次6 h、24 d固定器束縛應激,降低乙酰膽堿（acetylcholine, ACh）引起心血管疾病[16,30],發病率隨應激增加而升高[28]。固定器束縛應激0.2～1 h會增加機體體溫以及CORT水平[31];單次3 h、5 d的固定器束縛應激,使HPA軸激活,胃酸、胃酶分泌增多,產生胃潰瘍疾病[19,32]。

單次6 h分別實施1 d、2 d、3 d網罩束縛,會誘發鼠科內分泌系統指標改變[18]。未見網罩束縛應激導致鼠科器質性病變的報道。

1.3.2 置高臺應激對機體的影響

實驗研究中,利用鼠科的畏高特性,可制備置高臺應激模型[33-34]。單次30 min置高臺應激時鼠科會表現出勃起、長達10 min的靜止不動、排便、排尿等行為性“凍結”[35]。研究發現,單次30 min的置高臺應激可以損傷鼠科空間參考記憶提取能力[36]。但置高臺應激可降低鼠科糖尿病模型血糖水平[2]。置高臺應激對鼠科的生理、病理有一定影響,但未見器質性病變報道。

1.3.3 懸吊應激對機體的影響

懸吊應激會造成鼠科消化系統器質性病變、整體行為認知、內分泌系統和神經系統等生理、病理改變。單次6 h懸吊應激狀態中鼠類體溫逐漸下降,懸吊加束縛應激還可導致胃潰瘍[37]。重復應激使動物逐漸產生對應激的適應能力,減緩體溫下降。懸吊應激使鼠類性行為周期改變、學習記憶能力降低[38]。

不同固定方式對鼠科基礎生理指標、行為學及各系統的影響見表1。

表1 不同固定方式對鼠科基礎生理指標、行為學及各系統的影響

2 固定應激對針灸效應的干預

2.1 束縛固定

針灸實驗研究中,捆綁束縛[21]的松緊度很難控制;固定器和網罩類束縛方法,雖可以使鼠類處于俯臥自然狀態,但鼠類均處于強迫體位。針刺時,動物因疼痛發生掙扎,導致體位改變,取穴不準,針刺深度也很難把握,甚至掙脫而咬傷實驗人員,如太緊則易導致動物肢體缺血壞死[39]。

研究表明,針灸實驗中采用束縛固定可使鼠類出現毛色暗淡無光,精神緊張狀態、萎靡、焦躁,食欲減退,甚至出現嘔吐、便溏現象等不良應激反應[40]和降低糖尿病模型血糖水平的良性應激反應[2]。但束縛和針刺均能明顯降低糖尿病模型的血糖水平,束縛應激效應顯著,在此效應疊加基礎上難以準確評估針刺效應[2]。也有研究表明,用特殊束縛裝置對鼠類進行固定30 min不會影響鼠科的體質量和學習記憶能力及視力,束縛本身沒有使被固定的鼠類產生應激反應影響實驗結果[41]。

單次束縛應激0.5～6 h,總時長1～24 d,均產生不同程度的應激反應。在針灸動物實驗中,固定時間多為 30 min,刺激時間短,可使動物產生適應性,減小應激不良反應。

束縛固定應激中超過一定程度可產生強應激,引起生理、病理改變,對針灸效應產生影響。因此在針灸機制研究中,盡量避免采用束縛固定方法。如果采用束縛固定方法,固定時間盡量維持在30 min以內。

2.2 置高臺固定

在針灸實驗研究中,置高臺固定法能有效地減少束縛應激對動物模型與針刺效應的影響。有研究[2]表明,在置高臺情況下,去除置高臺的本底效應,針刺仍然對糖尿病大鼠血糖有明顯下調作用,針刺的效應可得到明顯體現。采取置高臺固定時,動物處于俯臥位的自然體位,因此該方法適用于針灸實驗中動物的頭背部、四肢外部的針灸治療。

為了減小動物因置高臺產生的應激反應,正式實驗前可做2～5次適應性訓練。置高臺固定產生較小應激,對生理、病理影響較小,對針刺效應的干預也較小,因此在針灸機制研究中,推薦采用置高臺固定方法。

3 應激評價方法在針灸研究中的應用

不同種類、程度的應激對動物的影響存在差異,并與動物狀態（疾病模型）密切相關。因此,在針刺研究中,要根據動物狀態（疾病模型）、穴位等實驗條件,依據應激評價,選用合適的固定方法。在針灸實驗研究中,應激的評價方法主要包括行為學評價、基本生理指標檢測、實驗室指標評價等。

行為學評價方法包括動物整體狀態評價[42]、強迫游泳實驗[42-43]、曠場實驗[43]、水迷宮實驗[44]、蔗糖攝取實驗[45]等。其中動物整體狀態評價方法更適合于針灸研究領域。應激使大鼠產生明顯的行為變化,如排便、站立不動、尖叫、發出超聲波、不斷的趟淚,皮毛和面部不潔、毛須樹立、長期不動等[42]。應激大鼠眼周偶爾有粉紅色分泌物。急性應激可導致動物行為活動增加,而慢性應激可導致行為活動減少,動物隨應激時程延長,其行為表現為由興奮狀態轉變為抑制狀態。

實驗室指標主要包括腎上腺糖皮質激素、兒茶酚胺和CORT。應激主要激活HPA軸,下丘腦產生CRH,經垂體門脈系統進入垂體前葉,刺激 ACTH的釋放,ACTH作用于腎上腺皮質,促進CORT的分泌,而CORT的分泌反過來又抑制ACTH和CRH的釋放,形成負反饋機制。研究表明,束縛應激后小鼠血清中CORT水平較正常明顯升高[46]。除了以上指標外,內分泌軸系統也參與應激反應。因此,可以反應應激的常用指標除去甲腎上腺素、甲狀腺素、CRH、ACTH和CORT外,還有阿片肽、多巴胺、生長抑制素和P物質等。其中,CORT是評價針灸研究中最常見的應激指標之一,可以高度準確地反映動物對急性應激源的反應。相關研究表明,中性粒細胞:淋巴細胞比率（NE:LY）也可以有效評價慢性應激。實驗室指標相對客觀地反映動物整體激素水平的變化[25]。因此,生長代謝、神經內分泌和免疫功能相關指標,都可用于應激評價。由于實驗室指標評估并不能區分困擾或輕度痛苦,因此應綜合參考行為學評價與實驗室指標進行應激的有效評估[47]。

4 討論

在針灸效應評價中,應該充分考慮固定應激對動物機體生理、病理的影響以準確評價針灸療效。應激產生的良性反應,有助于疾病的改善,因此忽略應激良性效應因素可能導致針灸的治療效應加大,或產生假陽性結果;應激產生的損傷性反應,可能導致疾病的進一步加重,忽略應激非良性效應因素可能導致針灸的治療效應減小,或產生假陰性結果。在針灸實驗研究中,因固定導致的應激很難避免,為了實驗的準確性,應盡量減小固定應激對針灸效應的干預,或在實驗中設置固定對照組用于分析應激效應對于針灸效應的影響。為了明確固定方法對針灸效應的干預,在正式開展實驗前,應首先進行應激評估,并在此基礎上選擇合適的動物固定方法。

應激評估過程包括①在正式實驗前進行應激評估預實驗,根據行為學指標與實驗室指標,對實驗動物因固定而產生的應激進行評估;②正式實驗前動物進行固定適應性鍛煉,通過訓練,使動物產生適應,以達到最小化應激反應,避免對針灸療效產生過大影響[38];③在正式實驗中,對鼠類的單次固定時間盡量控制在30 min以內;④在針灸治療疾病模型療效評估時,應關注固定應激對相關指標的干預。

固定方法的選擇原則具體為①治療取穴位于動物頭背部、四肢外側等部位,建議優先選擇置高臺固定法,其次選擇網罩、固定器固定;②治療取穴位于動物腹部、四肢內側等部位,建議選擇網罩或固定器固定;③常規情況下不建議采用捆綁固定法。如果在特殊實驗條件下,不適合采用置高臺、網罩、固定器固定等方法,最終可考慮采用捆綁固定法。