基于二代測序的碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌的分子特征分析*

陳典典，曹敬榮，白向榮，楊文碩，王培昌△

首都醫科大學宣武醫院:1.檢驗科;2.藥學部，北京 100053

肺炎克雷伯菌(KP)是社區獲得性感染和院內感染最常見的致病菌之一，臨床上根據其致病性的強弱分為經典型肺炎克雷伯菌(cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)[1]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，hvKP菌株的耐藥性也逐漸增加，且已有產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)hvKP的報道[2]，而隨著耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(CRKP)在臨床上的大量出現，碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)分離株的報道越來越多[3]。CR-hvKP菌株不僅具有CRKP菌株的高耐藥性和傳播性，還具有hvKP菌株的高致病性，使得臨床治療非常棘手。既往研究發現，CRKP主要集中于CC258克隆復合群的ST11型和ST258型[4]，hvKP主要集中于CC258克隆復合群中的ST23、ST65及ST86型[5]。而二代測序為全面了解細菌耐藥、毒力基因分布、分子型別等的可靠方法，因此，為進一步明確本院分離的CR-hvKP菌株，尤其CC258流行株的基因分布與分子特征，本研究收集本院分離的17株CR-hvKP，進行了二代測序，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院檢驗科2016—2020年臨床分離的17株CR-hvKP為研究對象。入選標準：改良碳青霉烯類滅活試驗(mCIM)與EDTA-碳青霉烯類滅活試驗(eCIM)陽性，毒力表型試驗陽性，且同時存在耐藥基因KPC-2及毒力基因rmpA或Areo的CRKP菌株。排除標準：mCIM試驗、eCIM試驗和毒力表型試驗陰性，PCR方法檢測不到耐藥或毒力基因。

1.2菌株篩選方法 通過Whonet5.6軟件篩選研究菌株，菌株的分離培養步驟按照《全國臨床檢驗操作規程(第4版)》進行操作，使用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)儀(德國布魯克公司)進行細菌鑒定，采用Vitek 2 Compact細菌藥物敏感分析系統進行藥敏試驗，藥敏試驗結果判斷參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)相關標準執行。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則和本院臨床研究相關規定，研究方案通過本院醫學倫理委員會批準(批件號：臨研審2020052號)。

1.3二代測序方法 參考文獻[6]，首先將留存菌株接種于血平板(英國Oxoid公司)進行復蘇，35 ℃過夜培養后挑取單菌落進行液體培養。使用DNA試劑盒(美國Qiagen公司)提取細菌總DNA。采用Hisep 2500型Illumina高通量測序儀(美國Illumina公司)進行二代測序。使用SOAP、Spades、Abyss軟件對測序結果進行數據拼接組裝，采用CISA軟件進行整合，對結果進行最終優化處理，得到的基因組序列用于后期分析。

1.4耐藥、毒力基因和莢膜血清型的分子生物信息學分析 基因組序列首先使用GeneMarkS軟件進行細菌的編碼基因預測。使用綜合抗菌藥物耐藥基因數據庫(ARDB)進行耐藥基因分析。通過RGI軟件與ARDB數據庫中已知耐藥基因進行比對，得到耐藥性相關基因的名稱及耐受的抗菌藥物種類等信息。使用毒力因子數據庫(VFDB)分析毒力基因、功能和致病機制。通過Diamond軟件與VFDB數據庫已知毒力基因進行比對，得到毒力基因的名稱、基本特征描述、毒力基因功能和致病機制信息；將得到的基因組數據提交到NCBI數據庫，與已知的莢膜血清型(K1-K82、KL103-KL125、KN1和KN2)序列進行比對[7]，得到檢測菌株的血清型數據。耐藥和毒力基因選擇鑒定率≥90%基因進行分析統計。

1.5多位點序列分型(MLST)和分子克隆(CC) 將組裝后的基因組數據提交NCBI數據庫，利用7個管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)序列結果進行在線比對(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)，將比對的等位基因編碼組合與MLST庫中已經提交的KP等位基因編碼組合進行對比，獲得MLST分型。將本研究獲得的等位基因序列與eBURST網站(http://eburst.mlst.net)中的數據庫進行比對可得到CC鑒定結果(7個等位基因有6個相同定義為同一克隆系)。

1.6統計學處理 采用Whonet5.6軟件和SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P<0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1菌株標本來源及耐藥情況 非重復的17株CR-hvKP中，16株(94.1%)分離自痰液標本，1株(5.9%)分離自尿液標本，復蘇后均經MALDI-TOF MS二次鑒定。17株CR-hvKP均為多重耐藥菌株，對β-內酰胺類(第一、二、三代頭孢菌素，碳青霉烯類，復合酶抑制劑類)、喹諾酮類(環丙沙星和左氧氟沙星)、頭霉素類(頭孢西丁)抗菌藥物均表現為100.0%耐藥，對復方磺胺甲噁唑耐藥率最低，為23.5%；對阿米卡星和慶大霉素耐藥率為76.5%，未發現對替加環素和多黏菌素耐藥的菌株。

2.2CR-hvKP的分子分型和克隆型別 17株CR-hvKP菌株中10株為國際流行的CC258型克隆復合群ST11型，7株為國際上未分型的MLST新序列型別(新ST型)，CR-hvKP的MLST分型結果和克隆型別見表1。新ST型與ST11型的phoE等位基因不同，由phoE的1號等位基因點突變為419號等位基因，見圖1。

表1 CR-hvKP的MLST分型結果和克隆型別

注：ST11型第58個堿基為C，新ST型變為T。

2.3CR-hvKP的耐藥基因分析 對基因組測序結果進行耐藥基因分析，共檢出29種耐藥基因，涉及8類抗菌藥物耐藥表型，見圖2。17株CR-hvKP各自攜帶18～25個耐藥基因，見圖2。新ST型與ST11型相比所攜帶的耐藥基因存在較多差異：7株新ST型菌株均攜帶兩種及以上blaCTX-M基因，而ST11型僅1株(10%，1/10)攜帶兩種blaCTX-M基因(blaCTX-M-65和blaCTX-M-27)；新ST型中blaTEM-1基因占14%(1/7)，ST11型為70%(7/10)；blaTEM-2基因僅存在于新ST型菌株，而blaOXA-1基因僅在ST11型中出現，見圖2。CR-hvKP基因組中存在多種耐藥基因，包括5種氨基糖苷類的基因(aph6id、aac6ib、ant2ia、acrb、acra)，3種甲氧嘧啶耐藥基因(dfra14、dfra12、dfra1)，2種大環內酯類的耐藥基因(mpha、macb)，2種磷霉素耐藥基因(mdth、mdtg)，2種四環素耐藥基因(tetc、teta)，磺胺類耐藥基因(sul1)、喹諾酮類耐藥基因(mdtk)和氯霉素類耐藥基因(catb3)各1種。ST11型菌株攜帶的耐藥基因較新ST型菌株更加復雜多元化。見圖2。

2.4CR-hvKP毒力基因分析 17株CR-hvKP 菌株共檢測到兩種莢膜血清型，包括14株(82.4%，14/17)KL64和3株KL47(17.6%，3/17)。10株ST11型菌中有7株(70.0%，7/10)為KL64，3株(30%，3/10)為KL47，7株新ST型菌株均為KL64型(100.0%，7/7)。CR-hvKP菌株毒力基因數據分析共獲得60多種相關毒力基因，包括鐵載體編碼基因氣桿菌素(iutA、iucA、iucB、iucC、iucD等)、耶爾森菌素(ybtA、ybtD、ybtE、ybtP、ybtQ、ybtS、ybtT、ybtU、irp1、irp2等)、沙門菌素(iroN)、腸桿菌素(ydbA、SenB/TieB、fepC)，莢膜多糖編碼基因Capsule(galF、wza等)、脂多糖編碼基因LPS(wbb0和wzm)、高黏液表型調節因子(rmpA、rmpA2)、菌毛相關編碼基因(mrkA、fimH等)、轉錄調控因子(RcsAB、fur)，以及Ⅳ型分泌系統相關編碼基因等。有12株CR-hvKP菌株同時檢測出iucA、rmpA、rmpA2和iroN基因。見圖3。

注:0為未攜帶該基因；1為攜帶1種亞型基因；2為攜帶2種亞型基因；3為攜帶3種亞型基因。

注：0為未攜帶該基因；1為攜帶1種亞型基因；2為攜帶2種亞型基因。

2.5耐藥與毒力基因差異分析 ST11型流行株與新ST型菌株中，耐藥基因blaCTX-M-27、blaTEM-1、blaTEM-2、ant2ia、sul1和毒力基因rmpA分布比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CR-hvKP分離株不同ST型菌株的主要差異耐藥基因和毒力基因分布[n(%)]

3 討 論

既往臨床認為hvKP除對氨芐西林天然耐藥外，對臨床常用抗菌藥物保持高敏感性，隨著CRKP的分離率日益增加，目前已有hvKP耐藥性增加的報道[8-10]，尤其CR-hvKP的報道逐漸增多，使得臨床上最為廣泛使用的碳青霉烯類藥物無法有效控制KP感染，臨床治療難度增加，甚至引起了醫院內感染暴發流行[11]。本研究通過對臨床分離自痰液和尿液標本的17株CR-hvKP菌株的基因序列進行分析，描繪了其攜帶的耐藥基因、毒力基因、分子型別等相關分子生物信息學的分布情況，以期為臨床制訂治療策略提供相應的理論依據。

CR-hvKP二代測序結果顯示，17株菌株均為國際流行的CC258克隆復合群，其中ST11型為主要流行株，與全國細菌耐藥檢測網(CHINET)報道結果一致[12]。17株CR-hvKP攜帶多種與抗菌藥物耐藥相關的基因，包括β-內酰胺類基因(blaTEM、blaCTX-M和blaSHV)和碳青霉烯酶基因(blaKPC和blaOXA)[13-14]，其中編碼絲氨酸酶KPC基因(blaKPC-2)存在于全部CR-hvKP菌株中，是本院KP最常見的耐碳青霉烯類抗菌藥物的決定性基因[15]。臨床應重視位于質粒上的blaKPC-2、blaCTX-M和blaTEM基因[16]，以防止這些基因在細菌間水平轉移產生更多耐藥菌，甚至引起醫院內感染的暴發流行。β-內酰胺類耐藥基因方面，所有CR-hvKP均檢測出blaCTX-M基因，ST11型菌株主要為blaTEM-1基因，但新ST型菌株攜帶了更多的blaCTX-M亞型(兩種以上)，如blaTEM-2[17]，TEM-2含有賴氨酸，識別水解抗菌藥物的能力強于TEM-1，ST11型流行株與新ST型菌株耐藥基因blaTEM-1、blaTEM-2檢測結果有明顯差異；blaCTX-M-65是ST11型和新ST型菌株中檢測出最多的β-內酰胺類亞型，但新ST型中存在更多的blaCTX亞型，可能與其存在更復雜的耐藥機制及存在耐藥進化有關，表明新ST型菌株在耐藥方面情況更復雜，更嚴峻。另外，本研究的CR-hvKP基因組中還檢測到了除上述基因外的其他類型的耐藥基因,這些基因有可能導致產生耐藥譜更為廣泛的超級耐藥菌，對我國乃至國際公共衛生安全產生巨大威脅[18]。值得注意的是，新ST型與ST11型菌株相比，雖然體外藥敏實驗結果顯示ST11型對阿米卡星多為敏感，但是實際上新ST型基因組中氨基糖苷類耐藥基因ant2ia攜帶率明顯高于ST11型，造成體外藥敏實驗與耐藥基因攜帶情況相悖的原因仍需要進一步研究。由于體外實驗無法完全代表體內情況，此類藥物具體臨床療效仍需進一步確認。新ST型磺胺類藥物耐藥基因sul1的攜帶率高于ST11型，但體外藥敏實驗結果表現為新ST型與ST11型無明顯差異，所以復方磺胺類藥物是否可用于治療新ST型感染需進一步深入研究。體外藥敏實驗未發現對替加環素和多黏菌素耐藥的CR-hvKP菌株，但檢測到tet耐藥基因，因此，臨床治療CR-hvKP感染時替加環素是否達到療效，有待進一步觀察研究。

毒力基因結果發現研究的菌株攜帶60多種毒力相關基因，包括莢膜多糖、與侵襲相關的基因、與黏附相關的基因、與莢膜形成相關的基因、與高毒力相關的rmpA/rmpA2基因、與宿主多部位散播感染和細胞內生長相關的鐵載體編碼基因、與生物膜相關的編碼基因和與宿主不同部位免疫防御相關的編碼基因。既往研究顯示，hvKP菌株中最常見的莢膜血清型為K1、K2、K5、K20、K54和K57，其中K1和K2最多見，而CR-hvKP菌株的血清莢膜分型目前文獻報道的有K1、K2、K20、KL64和KL47，中國的CR-hvKP菌株的莢膜血清分型以KL64型為主[19-20]。本研究中CR-hvKP菌株中14株(82.4%)為KL64，3株為KL47(17.6%)，與以往研究結果一致[21]。無論是ST11型還是新ST型的CR-hvKP中都包含上述所有類別的毒力基因，毒力基因總體分布無差異。但不同菌株毒力基因的數目有所不同，說明CR-hvKP在毒力方面仍呈進化趨勢。與ST11型相比，新ST型rmpA基因的攜帶率明顯較高，可能與新ST型形成時的點突變相關。既往研究發現，hvKP菌株常攜帶pLVPK質?；騪LVPK-like質粒，并可通過檢測iucA、rmpA、rmpA2和iroN基因初步判定是否攜帶兩種質粒[22]。本研究結果還顯示有12株菌均檢測出4種相關毒力基因，推測本院的CR-hvKP菌株可能為產KPC-2酶的ST11型CRKP菌株獲得相關毒力質粒進化而來，與國內報道一致[23]。毒力質粒相關研究及新ST型形成和進化機制將在未來試驗中進一步闡述。

綜上所述，本院CR-hvKP菌株全部是由CC258克隆系組成，主要為ST11型和新ST型流行株，ST11型仍是目前本院和國內臨床最常見的類型。CR-hvKP菌基因組存在多種碳青霉烯類耐藥基因及大量其他類型耐藥基因，攜帶多種毒力基因和兩種莢膜血清型(KL64和KL47)，不同MLST分型菌株的部分耐藥基因與毒力基因分布有差異。本研究為單中心回顧性觀察研究，樣本量較少，僅對研究菌株進行基因序列分析，未結合臨床特點和治療用藥等。因此，在未來研究中急需選取有代表性的CR-hvKP菌株進行全基因組篩查，結合患者臨床資料進行綜合分析，進一步揭示新ST型形成及CR-hvKP進化的具體機制，幫助臨床精準診斷，并為治療患者提供針對性的方案。