HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a、miR-92a的表達及其與預后的關系*

瑪依拉·艾尼瓦爾，湯新樂，張裕祥

新疆醫科大學第六附屬醫院檢驗科，新疆烏魯木齊 830002

人乳頭瘤病毒(HPV)的主要傳播方式為性傳播，多數女性在感染HPV后可自行清除，仍有部分患者無法完全清除，而當高危型HPV在機體長期處于高載量時，將會導致宮頸上皮內瘤變(CIN)或宮頸癌[1]。流行病學資料顯示，2012年全球范圍內約有52.76 萬例新發宮頸癌患者及26.57萬因宮頸癌死亡患者，且隨著社會的發展，宮頸癌呈年輕化、高發病率的趨勢[2-4]。近年來，手術、化療、放療等的綜合治療已成為早期宮頸癌的主要治療方式，宮頸癌患者5年生存率可達90%,但對于晚期及復發性宮頸癌患者5年生存率仍不足20%和5%[5]。因此，探討一種可用于指示宮頸癌發生及轉歸的特異性指標具有十分重要的意義。microRNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，在轉錄后負性調控靶基因的表達，并在腫瘤的發生、發展及侵襲中具有一定的調控作用[6-7]。有研究表明，miR-18a及miR-92a在多種實體瘤中呈過表達，提示其可作為新型腫瘤標志物用于腫瘤診斷及預后評價[8-10]。宮頸癌作為實體瘤之一，是否這一類患者也存在血清miR-18a、miR-92a過表達，二者對HPV陽性宮頸癌診斷及評估預后的臨床價值如何是筆者關注的重點之一。基于此，本研究擬分析HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a的表達，以及二者與預后的關系，旨在為臨床上診治HPV陽性宮頸癌患者提供相關依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年3月本院收治的79例HPV陽性宮頸癌患者為觀察組，79例HPV陽性宮頸上皮內瘤變患者為對照組。觀察組納入標準：(1)經病理檢查診斷為宮頸癌；(2)HPV檢測為陽性，分型為HPV16型或18型；(3)未接受放射治療、化療及生物免疫治療；(4)不存在其他惡性腫瘤或其他感染性疾病。對照組納入標準：(1)HPV檢測為陽性，分型為HPV16型或18型；(2)經病理檢查診斷為宮頸上皮內瘤變；(3)近3個月內未接受過抗菌藥物治療；(4)近1周內無性生活史。兩組排除標準：(1)合并免疫、內分泌等其他系統嚴重疾病；(2)處于經期或陰道不規則出血；(3)妊娠期或哺乳期女性；(4)依從性差，不能配合完成本研究；(5)既往有子宮手術史；(6)合并陰道炎或其他炎癥性疾病；(7)近1年內接受過放療、化療及生物免疫治療。所有納入研究對象及其家屬對本研究知情且同意，并簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2檢測方法 所有研究對象于入組次日清晨空腹抽取靜脈血5 mL。血液標本以3 000 r/min離心15 min，分離血清后提取總mRNA，采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法(Takara PCR試劑盒，日本Takara公司)檢測各組miR-18a及miR-92a水平。引物設計及合成均由北京鼎國生物科技有限公司提供，引物序列見表1。miR-18a及miR-92a下游通用引物來自Mir-XTM miRNA First Strand反轉錄試劑盒(日本Takara公司)。根據反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，根據SYBR RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)說明書進行RT-PCR。反應體系：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，循環35 次。采用2-ΔΔCt法檢測各組miR-18a 和 U6基因相對表達量，內參為U6，每份標本重復檢測3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3觀察指標 收集兩組研究對象基線資料，并比較兩組miR-18a及miR-92a水平。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miR-18a及miR-92a在診斷HPV陽性宮頸癌中的效能。比較不同年齡、病理類型、分化程度、腫瘤最大徑、血管浸潤、淋巴結轉移、臨床分期情況宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平。隨訪1年，觀察組根據存活情況分為存活組和死亡組，比較兩組miR-18a及miR-92a水平。分析miR-18a及miR-92a評估患者預后的效能。

2 結 果

2.1觀察組與對照組基線資料比較 觀察組與對照組年齡、產次等基線資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 觀察組與對照組基線資料比較

2.2觀察組與對照組血清miR-18a及miR-92a水平比較 與對照組比較，觀察組血清miR-18a及miR-92a水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組與對照組血清miR-18a及miR-92a水平比較

2.3不同特征HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平比較 HPV陽性宮頸癌患者中，與臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、血管浸潤陰性的患者比較，臨床分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、血管浸潤陽性的患者miR-18a及miR-92a水平更高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同特征HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平比較

2.4miR-18a及miR-92a水平對HPV陽性宮頸癌的診斷效能 當miR-18a截斷值為3.161時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.849(P<0.05)；當miR-92a截斷值為1.665時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.827(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 miR-18a及miR-92a水平對HPV陽性宮頸癌的診斷效能

圖1 miR-18a及miR-92a水平診斷HPV陽性宮頸癌的ROC 曲線

2.5存活組與死亡組血清miR-18a及miR-92a水平比較 與存活組比較，死亡組miR-18a及miR-92a水平更高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 存活組與死亡組血清miR-18a及miR-92a水平比較

2.6miR-18a及miR-92a水平評估HPV陽性宮頸癌預后的效能 當miR-18a截斷值為5.334時，評估HPV陽性宮頸癌預后的AUC為0.766(P<0.05)；當miR-92a截斷值為2.361時，評估HPV陽性宮頸癌預后的AUC為0.790(P<0.05)。見表7、圖2。

表7 miR-18a及miR-92a水平評估HPV陽性宮頸癌預后的效能

圖2 miR-18a及miR-92a水平評估HPV陽性宮頸癌預后的ROC曲線

3 討 論

宮頸癌的發生、發展與HPV感染、核苷酸多態性變化、染色體突變等因素密切相關[11-13]。隨著醫學的發展，對宮頸癌的分子生物學機制也有了深入研究。miRNA作為基因調控網絡中的關鍵因素，其參與多個信號通路的調控。已有研究證實，miRNA與多種腫瘤細胞的增殖、分化、遷移等生物學行為密切相關，并參與腫瘤的發生、發展過程[14-15]。在一項多因素分析研究中，HPV感染，以及miR-18a、miR-92a水平的上升均為宮頸癌發生的獨立危險因素[16]。但根據現有臨床經驗，HPV一過性感染比例較高，因此，通過HPV感染診斷宮頸癌的特異度較低。而miRNA以穩定、豐富的形式存在于血液中，因此，以血清為生物學標本，無創、操作簡便，更易提高患者的依從性。

miR-18a屬于miR-17-92基因簇成員，有研究表明，miR-18a可作為抑癌基因，通過調控其下游的靶基因進而抑制腫瘤細胞體外增殖，并誘導G1期阻滯，促進腫瘤細胞的凋亡[17-18]。但有研究發現，在乳腺癌、膠質母細胞瘤等多種腫瘤中，miR-18a的表達有所上升[19]。因此，miR-18在HPV陽性宮頸癌患者中是否表達異常是筆者探討的重點之一。miR-92a作為miRNA家族成員之一，其參與多種腫瘤細胞的發生、發展，并與腫瘤惡性程度呈正相關[9]。本研究結果顯示，相較于HPV陽性宮頸上皮內瘤變患者，HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92水平均明顯上升，這與既往研究結果一致，說明miR-18a及miR-92水平異常與HPV陽性宮頸癌發生關系密切。同時，本研究還發現，相較于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期患者、無淋巴結轉移、血管浸潤陰性的患者，臨床分期為Ⅲ期、有淋巴結轉移、血管浸潤陽性的患者miR-18a及miR-92a水平更高，這也說明血清miR-18a及miR-92a水平在一定程度上可反映宮頸癌惡性程度。本研究進一步通過ROC曲線分析了miR-18a及miR-92a水平在診斷HPV陽性宮頸癌患者中的臨床價值，結果顯示，當miR-18a截斷值為3.161時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.849(P<0.05)；當miR-92a截斷值為1.665時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.827(P<0.05)，說明miR-18a及miR-92a在診斷HPV陽性宮頸癌中均具有一定臨床價值，血清miR-18a及miR-92a檢測有望成為HPV陽性宮頸癌篩查的生物學標志物。目前，宮頸癌的發病率及病死率仍居高不下，且患者的預后較差，因此，探討其預后指標對于臨床上評估患者治療措施的效果具有重要的臨床意義。隨訪1年結果顯示在HPV陽性宮頸癌患者中，死亡組血清miR-18a及miR-92a均明顯高于存活組。ROC曲線結果顯示：當miR-18a截斷值為5.334時，評估HPV陽性宮頸癌預后的AUC為0.766(P<0.05)；當miR-92a截斷值為2.361時，評估HPV陽性宮頸癌預后的AUC為0.790(P<0.05)。提示血清miR-18a及miR-92a可作為評估HPV陽性宮頸癌患者預后的輔助指標。

綜上所述，HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平明顯上升，并在HPV陽性宮頸癌的診斷及預后評估中具有一定臨床價值。