H2O2-VC降解對(duì)香水蓮花多糖結(jié)構(gòu)與活性的影響

譚詩敏，羅志剛，程建華

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510640）

香水蓮花（Nymphaea hybrid）是睡蓮屬的大型睡蓮，在廣東、福建、云南、廣西、浙江等地都有種植基地。有黃、白、紅、藍(lán)等9種顏色，故又名“九品蓮花”。香水蓮花含有多糖、蛋白質(zhì)、酚類、黃酮、生物堿、鞣質(zhì)、纖維素等成分[1]。研究表明，香水蓮花多糖（N.hybridpolysaccharides，NHP），有良好的抗氧化、保濕活性[2-3]。前期實(shí)驗(yàn)制備的NHP分子質(zhì)量較大；由于高分子質(zhì)量多糖具有黏度大、溶解性差，生物利用度低等缺點(diǎn)[4-5]。對(duì)NHP進(jìn)行適度降解，有望在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用[6-7]。

H2O2氧化法是近年來應(yīng)用較多的多糖降解方法，利用H2O2分解產(chǎn)生的羥自由基氧化斷裂多糖間糖苷鍵，該方法綠色環(huán)保且可控性強(qiáng)[8]。但由H2O2自發(fā)產(chǎn)生羥自由基進(jìn)行多糖降解過程緩慢，當(dāng)體系中同時(shí)加入H2O2和VC，H2O2能夠氧化VC，快速生成2,3-二酮古洛糖酸和羥自由基，與單一H2O2體系相比，低濃度VC的加入顯著增加了自由基的數(shù)量，多糖的降解速率明顯提高[9-10]。Zhang Zhongshan等[11]發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2-VC能夠在短時(shí)間內(nèi)降低蓮子多糖黏度，提高多糖抗氧化活性，該反應(yīng)對(duì)多糖的主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)無明顯改變[12]。目前，關(guān)于降解NHP的方法及其產(chǎn)物性質(zhì)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，因此，本研究采用H2O2-VC體系降解多糖，系統(tǒng)研究降解對(duì)多糖分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)、流變性和其他功能特性的影響，以期為香水蓮花的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃色香水蓮花產(chǎn)于廣東珠海；無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、30% H2O2（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；抗壞血酸、氫氧化鈉、三氟乙酸、剛果紅、溴化鉀、大豆卵磷脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、三氯化鐵（均為分析純），磷酸二氫鉀（色譜純） 美國(guó)阿拉丁公司；玉米油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀、IC5000離子色譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；2695高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；DE 19720旋轉(zhuǎn)流變儀 美國(guó)TA公司；U2910紫外-可見分光光度計(jì) 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 NHP的制備

黃色香水蓮花粉末以料液比1∶5（g/mL）在95%乙醇溶液中80 ℃加熱回流3 h，脫色，除去脂溶性成分，抽濾后烘干濾渣。然后，采用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)輔助提取，稱取一定量已脫色的香水蓮花粉末，按料液比1∶30（g/mL）加入去離子水，650 W處理30 min（開5 min，關(guān)1 min）；隨后，80 ℃水浴攪拌提取3 h，離心得上清液并旋蒸至原體積的1/5。加入Sevag試劑（氯仿-正丁醇，1∶4（V/V））脫蛋白5 次，旋蒸除去殘留的有機(jī)試劑。最后，加入AB-8大孔樹脂，室溫磁力攪拌5 h脫色，抽濾得濾液；緩慢向?yàn)V液中加入4 倍95%乙醇溶液，4 ℃靜置12 h，沉淀真空干燥，得NHP。

1.3.2 香水蓮花降解多糖的制備

采用H2O2-VC對(duì)NHP溶液進(jìn)行可控降解，參照Li Junhui等[10]方法并稍作修改。根據(jù)前期已探究的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行降解，配制100 mmol/L H2O2、 5 mg/mL多糖溶液20 mL，加入20 mmol/L VC，60 ℃降解30、60、90 min。降解后調(diào)pH值至中性，去離子水透析48 h（3 500 Da），減壓蒸餾濃縮后凍干，得到3種降解多糖DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3。

1.3.3 分子質(zhì)量測(cè)定

采用凝膠滲透色譜測(cè)定NHP及3種降解多糖的分子質(zhì)量[13]。色譜條件：Ultrahydrogel 120、250、500色譜柱串聯(lián)（7.8 mm×300 mm），柱溫為35 ℃；2414示差檢測(cè)器；流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4溶液（pH 6），流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。用流動(dòng)相配制不同分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 mg/mL），測(cè)定保留時(shí)間，根據(jù)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測(cè)定多糖的出峰時(shí)間，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子質(zhì)量。

1.3.4 單糖組成測(cè)定

通過離子色譜測(cè)定NHP及3種降解多糖的單糖和糖醛酸組成[14]。稱取5 mg多糖于安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液10 mL，120 ℃水解3 h，用氮?dú)獯蹈蓛x吹干溶劑，加入5 mL水溶解，離心后取上清液進(jìn)離子色譜分析。色譜條件：DionexCarbopacTMPA20色譜柱（3 mm×150 mm），柱溫為30 ℃；電化學(xué)檢測(cè)器；流動(dòng)相：A為H2O，B為250 mmol/L NaOH溶液，C為50 mmol/L NaOH和500 mmol/L NaOAc溶液，流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.5 紅外光譜掃描

通過傅里葉紅外光譜掃描，分析NHP及3種降解多糖的結(jié)構(gòu)。多糖和KBr充分研磨后壓片，在4 000～500 cm－1波數(shù)內(nèi)掃描，得到紅外光譜。

1.3.6 剛果紅實(shí)驗(yàn)

參考Chen Xiaoyong等[15]的方法，稍作修改。將多糖溶液（1 mg/mL）和剛果紅溶液（100 μmol/L）等體積混合，加入不同濃度的NaOH溶液，使溶液濃度在0～0.5 mol/L內(nèi)，在波長(zhǎng)700～400 nm范圍內(nèi)紫外掃描，測(cè)定溶液的最大吸收波長(zhǎng)。用去離子水代替多糖溶液作空白對(duì)照組，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的凝膠多糖作陽性對(duì)照。

1.3.7 流變學(xué)特性測(cè)定

參考Yuan Dan等[16]的方法，配制20 mg/mL的多糖溶液，通過流變儀測(cè)定NHP及3種降解多糖的流變特性。測(cè)試間隙為1 mm，采用25 mm直徑的探頭。剪切速率掃描范圍為0.1～100 s－1，溫度為25 ℃，測(cè)定表觀黏度；恒定1 Hz頻率，角頻率掃描范圍為0.1～100 rad/s，溫度為25 ℃，測(cè)定儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G’’）。

1.3.8 功能特性測(cè)定

1.3.8.1 持水性和持油性

參考Jeddou等[17]的方法。多糖分別用去離子水、玉米油配制成1 g/100 mL，測(cè)定NHP及3種降解多糖的持水性、持油性。

1.3.8.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性

參考Pearce等[18]的方法，稍作修改。以大豆卵磷脂作陽性對(duì)照，多糖配制成0.1 g/100 mL溶液，6 mL多糖溶液與3 mL玉米油混合，10 000 r/min均質(zhì)2 min，分別在0、10 min取50 μL乳液與5 mL的0.1 g/100 mL的SDS溶液混合，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算得乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1.3.9 抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基、羥自由基清除率測(cè)定參考馮燕如[13]的方法，2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-amino-di (3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）陽離子自由基清除率測(cè)定參考Xiao Heng等[19]的方法，VC作陽性對(duì)照，測(cè)定不同濃度NHP及3種降解多糖的自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2019數(shù)據(jù)處理及分析，Origin 2018 64bit繪圖，IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2-VC降解對(duì)多糖分子質(zhì)量的影響

在降解時(shí)間為0、30、60、90 min時(shí)測(cè)定多糖的分子質(zhì)量。如圖1所示，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰明顯向右偏移，說明H2O2-VC降解使多糖的分子質(zhì)量顯著下降。由表1可知，未降解多糖NHP分子質(zhì)量為1 122 kDa，降解多糖DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3分子質(zhì)量分別為129、46、15 kDa。

圖1 NHP和DNHP的凝膠滲透色譜圖Fig.1 Gel permeation chromatographic (GPC) profiles of NHP and DNHP

表1 NHP和DNHP的理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of NHP and DNHP

2.2 單糖組成分析

如圖2所示，NHP主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成。半乳糖醛酸含量較高，說明是果膠類多糖。3種降解多糖的單糖種類與NHP相同，說明H2O2-VC降解沒有改變多糖的單糖類型。H2O2-VC降解條斑紫菜多糖中也有相似的發(fā)現(xiàn)[20]。由表1可知，降解后單糖占比發(fā)生了改變，半乳糖醛酸、甘露糖含量下降，鼠李糖含量增加。半乳糖醛酸含量下降，說明H2O2-VC產(chǎn)生的羥自由基更易作用于果膠多糖主鏈聚半乳糖醛酸區(qū)的糖苷鍵，這與超聲加速H2O2降解果膠多糖的結(jié)果相似[10]。在側(cè)鏈中，羥自由基優(yōu)先攻擊甘露糖附近的糖苷鍵，其次攻擊木糖、阿拉伯糖等中性糖附近的糖苷鍵，而在鼠李糖附近的糖苷鍵較穩(wěn)定，斷裂的短糖鏈在透析過程中除去，可能是甘露糖含量下降、其他中性糖含量變化不大、鼠李糖富集的原因。

圖2 NHP和DNHP的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of NHP and DNHP

2.3 紅外光譜分析

如圖3所示，NHP和DNHP的特征吸收峰相似，說明降解后沒有改變多糖的主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。在3 378 cm－1處為O—H伸縮振動(dòng)峰。1 744、1 615 cm－1處為果膠多糖的特征吸收峰[21]，多糖降解后，峰強(qiáng)度變?nèi)酢? 615 cm－1和1 440 cm－1處的吸收峰說明多糖降解前后都含有糖醛酸[16]。在1 024 cm－1處為果膠多糖中半乳糖醛酸的特征吸收峰[22]，910 cm－1和536 cm－1處表明了α-糖苷鍵的存在[6]。

圖3 NHP和DNHP的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of NHP and DNHP

2.4 三股螺旋結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知，與空白組對(duì)比，當(dāng)NaOH濃度為0 mol/L時(shí)，NHP和DNHP的最大吸收波長(zhǎng)沒有發(fā)生紅移，說明多糖降解前后都不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)NaOH濃度逐漸增加時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)逐漸減少，說明堿液破壞了多糖的氫鍵[23]。

圖4 NHP和DNHP在不同濃度NaOH中與剛果紅溶液的最大吸收波長(zhǎng)Fig.4 Maximum absorption wavelengths of mixtures of Congo red with NHP or DNHP at different NaOH concentrations

2.5 流變學(xué)分析

由圖5A可知，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的表觀黏度顯著下降。未降解多糖NHP的表觀黏度隨剪切速率增加而降低，這是典型的剪切變稀現(xiàn)象，說明NHP是非牛頓流體。DNHP-1和DNHP-2在低剪切速率0.1～10 s－1內(nèi)，呈現(xiàn)剪切變稀，然而在高剪切速率10～100 s－1內(nèi)，表觀黏度幾乎不變，接近牛頓流體。此外，DNHP-3的表觀黏度隨剪切速率的增加幾乎保持不變，表明DNHP-3接近牛頓流體。這可能是因?yàn)殡S著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖鏈糖苷鍵斷裂的數(shù)量增多，導(dǎo)致分子間相互作用力減弱，多糖鏈發(fā)生解聚，多糖重新纏結(jié)的速度低于斷裂速度[24]。這些結(jié)果表明H2O2-VC降解顯著改變了多糖的流變行為，這與已有報(bào)道黑加侖多糖在高超聲功率下也轉(zhuǎn)化為牛頓流體相似[25]。

由圖5B可知，降解前后多糖的G’和G’’隨角頻率增加而增加，DNHP的模量低于NHP。NHP與DNHP溶液均具有黏彈性，在低頻率時(shí)G’’大于G’，表現(xiàn)為液體黏性；在高頻率時(shí)G’’小于G’，表現(xiàn)為弱凝膠性質(zhì)。此外，4種多糖的交叉頻率分別為43.18（NHP）、15.85（DNHP-1）、10.00 rad/s（DNHP-2）和2.51 rad/s（DNHP-3），表明隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的交叉頻率逐漸降低。Gao Jie等[26]認(rèn)為低交叉頻率具有更好的凝膠和穩(wěn)定性能。因此，降解提高了多糖的固體彈性，為其在食品、化妝品等領(lǐng)域的添加提供了理論依據(jù)。

圖5 NHP和DNHP的流變性Fig.5 Rheological properties of NHP and DNHP

2.6 功能特性分析

持水性用于評(píng)價(jià)樣品結(jié)合水的能力，與樣品增稠、穩(wěn)定能力及質(zhì)構(gòu)、感官性質(zhì)密切相關(guān)[27]。如圖6A所示，與NHP（（1.50±0.11）%）相比，DNHP的持水性分別為（3.12±0.02）%、（3.11±0.16）%、（3.42±0.13）%，說明多糖分子質(zhì)量越小，持水性越高。這可能是NHP降解后，暴露出來的羥基比例增加，從而促進(jìn)多糖的持水能力。NHP的持油性為（11.04±0.29）%，顯著高于DNHP。此外，隨著分子質(zhì)量的降低，持油性逐漸降低。高分子質(zhì)量的多糖，黏度較大，與油分子結(jié)合的能力更強(qiáng)[28]。NHP的持水性、持油性均優(yōu)于刺梨多糖、藍(lán)靛果多糖[24,29]，說明NHP和DNHP可用作食品中保水劑、風(fēng)味保持劑。

如圖6B所示，NHP和DNHP的乳化活性與乳化穩(wěn)定性均低于常用乳化劑大豆卵磷脂。與DNHP相比，NHP的乳化活性與乳化穩(wěn)定性分別為（39.92±1.22） m2/g、（21.04±0.45） min，高于DNHP，說明多糖降解后乳化性降低。推測(cè)原因是降解后蛋白質(zhì)含量降低，NHP中的支鏈結(jié)構(gòu)與少量蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，增強(qiáng)多糖乳化能力[17]。此外，高支鏈結(jié)構(gòu)、高分子質(zhì)量的多糖乳化性更強(qiáng)[30]，因此推測(cè)多糖分子質(zhì)量大小與乳化性正相關(guān)。

圖6 NHP和DNHP的功能特性Fig.6 Functional characteristics of NHP and DNHP

2.7 抗氧化活性分析

由圖7A、B可知，在0.125～2 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，NHP與DNHP對(duì)DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除率呈劑量依賴性。在同一質(zhì)量濃度下，DNHP-2對(duì)DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除率均高于NHP及其他降解多糖，低于VC。NHP、DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3清除DPPH自由基的IC50分別為0.93、0.74、0.48、0.57 mg/mL；質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，清除率分別為（65.18±1.06）%、（74.29±2.18）%、（87.65±0.71）%、（85.47±1.71）%。清除ABTS陽離子自由基的IC50分別為0.73、0.54、0.41、0.44 mg/mL；質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，清除率分別為（69.36±0.54）%、（77.37±1.29）%、（87.13±0.84）%、（82.81±0.52）%。說明DNHP對(duì)DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除率均高于NHP。清除能力按從高到低順序?yàn)閂C＞DNHP-2＞DNHP-3＞DNHP-1＞NHP。

由圖7C可知，在0.25～4.00 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，NHP與DNHP對(duì)羥自由基的清除率與質(zhì)量濃度正相關(guān)。NHP、DNHP-1、DNHP-2、DNHP-3清除羥自由基的IC50分別為2.41、1.88、1.16、1.80 mg/mL，高于VC（0.25 mg/mL）。相同質(zhì)量濃度時(shí)，DNHP-2對(duì)羥自由基的清除率均高于NHP及其他降解多糖。質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時(shí)，多糖清除率分別為（65.68±0.89）%、（74.35±1.33）%、（82.69±0.32）%、（80.17±1.24）%。清除能力按從高到低順序與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基一致。

圖7 NHP和DNHP的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of NHP and DNHP

研究表明，多糖的抗氧化活性與溶解度、單糖組成、黏度、分子質(zhì)量、三股螺旋結(jié)構(gòu)等性質(zhì)緊密相關(guān)，其中，分子質(zhì)量對(duì)多糖抗氧化活性有顯著影響[31]。低分子質(zhì)量多糖的游離羥基比例高，通過直接與自由基作用終止自由基鏈反應(yīng)或提供電子將自由基還原為更穩(wěn)定的形式，從而提高抗氧化活性[6]。多糖降解后溶解度增加，能夠與自由基接觸的活性位點(diǎn)增多[12]。NHP與DNHP在單糖種類、官能團(tuán)與三股螺旋結(jié)構(gòu)上相似，說明NHP抗氧化活性的提高與分子質(zhì)量降低，黏度降低，溶解度增加及單糖濃度占比改變相關(guān)。此外，當(dāng)降解時(shí)間為60 min時(shí)，制備的DNHP-2在降解多糖中抗氧化效果最佳，說明在降解中合理控制時(shí)間對(duì)提升多糖活性有重要意義，這與超聲降解馬尾藻多糖的結(jié)果一致[16]。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用H2O2-VC聯(lián)合降解NHP，制備了3種低分子質(zhì)量多糖DNHP，分子質(zhì)量分別為129、46、15 kDa。3種降解多糖的單糖種類與未降解多糖一致，但濃度占比存在差異，降解體系生成的羥基更易攻擊HG區(qū)的半乳糖醛酸。H2O2-VC降解后多糖的主要官能團(tuán)結(jié)構(gòu)沒有改變。隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的表觀黏度下降，固體彈性增加，降解顯著改變了多糖的流變行為。此外，NHP具有良好的持油性、乳化性，DNHP具有較好的持水性。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，降解后多糖對(duì)自由基清除能力顯著提高，其中抗氧化效果最佳的多糖為降解時(shí)間60 min的低分子質(zhì)量DNHP-2多糖。這些結(jié)果表明控制H2O2-VC降解時(shí)間能夠改變NHP的分子質(zhì)量、流變性和其他功能特性。因此，NHP在食品、化妝品和藥品中有潛在應(yīng)用。