基于QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)食用菌中8種煙堿類(lèi)化合物

陳榮鋒，陳鳳明，潘裕添，張國(guó)廣,，張 峰,

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建 漳州 363000；3.國(guó)家衛(wèi)生健康委職業(yè)安全衛(wèi)生研究中心，北京 102308）

煙堿類(lèi)化合物是一類(lèi)含有氮雜環(huán)的堿性物質(zhì)，目前已鑒定的有40多種，包括尼古丁、可替寧、新煙堿、二烯煙堿、去氫新煙堿、2,3’-二聯(lián)吡啶、麥斯明、降煙堿8種主要的生物堿，其中尼古丁含量最高[1]。尼古丁會(huì)使人上癮或產(chǎn)生依賴(lài)性，重復(fù)使用會(huì)增加心率和升高血壓并降低食欲。大劑量的尼古丁會(huì)引起嘔吐以及惡心，嚴(yán)重時(shí)人會(huì)死亡[2]。

2008年11 月，有德國(guó)實(shí)驗(yàn)室公布中國(guó)產(chǎn)牛肝菌干片尼古丁含量超標(biāo)，德國(guó)禁止中國(guó)的牛肝菌干片在德國(guó)市場(chǎng)上銷(xiāo)售[3]。隨后牛肝菌干片在德國(guó)、意大利、法國(guó)等國(guó)的銷(xiāo)售受到嚴(yán)重阻礙，牛肝菌面臨在歐盟退市的危機(jī)[4]。我國(guó)科研工作者通過(guò)對(duì)不同品種食用菌的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，很多野生食用菌中含有尼古丁，包括歐州在內(nèi)的不同產(chǎn)地產(chǎn)品。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合調(diào)研情況得出結(jié)論：尼古丁在此類(lèi)低等植物中是普遍存在的內(nèi)源性微量物質(zhì)。從而為中國(guó)的牛肝菌出口挽回巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)歐盟食品安全委員會(huì)調(diào)查并對(duì)食用菌[5-9]中尼古丁限量作出緊急修訂，尼古丁在食用菌鮮品和干品（不含牛肝菌）中最高限量分別為0.036 mg/kg和1.17 mg/kg，而在牛肝菌干品的最高限量則為2.3 mg/kg。此后，食用菌類(lèi)中煙堿類(lèi)物質(zhì)引起了廣大科研工作者的關(guān)注。

目前僅見(jiàn)檢測(cè)煙草和體液中此類(lèi)生物堿的研究，采用分光光度法[10-11]、光譜法[12-13]、毛細(xì)管電泳法[14]、氣相色譜法[15-17]、液相色譜法[18-19]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[24-30]等。分光光度法針對(duì)官能團(tuán)相同的化學(xué)性質(zhì)，能夠測(cè)定一類(lèi)物質(zhì)如煙堿類(lèi)總生物堿的含量，但對(duì)于其中各生物堿含量則無(wú)法測(cè)定。光譜法建模較難，而且對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜樣品專(zhuān)屬性不強(qiáng)。電化學(xué)分析法和示波極譜法應(yīng)用范圍較小。毛細(xì)管電泳影響因素多，操作復(fù)雜。高效液相色譜法檢測(cè)靈敏度不高，難以得到結(jié)構(gòu)信息，在對(duì)復(fù)雜混合未知物的結(jié)構(gòu)分析方面顯得薄弱，在常規(guī)紫外檢測(cè)器上對(duì)無(wú)紫外吸收化合物的檢測(cè)和大量未知化合物的定性分析還需依賴(lài)于其他手段。而色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜技術(shù)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的分離能力和質(zhì)譜檢測(cè)器高靈敏度高專(zhuān)屬性的特點(diǎn)，對(duì)煙堿類(lèi)化合物的檢測(cè)更具有優(yōu)勢(shì)。

本研究對(duì)食用菌中8種煙堿類(lèi)化合物用QuEChERS提取凈化，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行分析研究，具有處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可滿(mǎn)足食用菌中8種煙堿類(lèi)化合物的快速測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食用菌（銀耳、香菇、黑木耳、猴頭菇、口蘑）、屈臣氏純化水 市場(chǎng)。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國(guó)迪馬公司；可替寧（純度99.8%）、降煙堿（純度98.8%）、新煙堿（純度98.7%）、二烯煙堿（純度99.6%）、去氫新煙堿（純度98.2%）、2,3-聯(lián)吡啶（純度98.7%）、麥斯明（純度99.8%）、尼古丁（純度99.3%）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Chromadex公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 5500 LC/MS/MS系統(tǒng)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）、高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱） 美國(guó)AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨溶液、B為乙腈，等度洗脫（A∶B，20∶80，V/V），流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用ESI源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式，氣簾氣流速20 L/h，霧化氣流速55 L/h，輔助氣流速55 L/h，輔助加熱氣溫度650 ℃，噴霧電壓5 500 V。去簇電壓80 V，碰撞電壓分別為25 V和35 V。一級(jí)全掃描范圍為m/z50～500。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱(chēng)取10 mg各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度100 μg/mL的儲(chǔ)備液，貯存于－4 ℃。精密吸取適量的儲(chǔ)備液于容量瓶中，用流動(dòng)相定容，配成0.03～500 ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 樣品溶液制備

食用菌子實(shí)體，包括菌蓋和菌柄經(jīng)凍干后粉碎混勻，待用。樣品處理參考文獻(xiàn)[5,20]的方法，取樣品0.5 g（精確至0.01 g）置于50 mL試管中加入2 mL去離子水后渦旋2 min混勻樣品，靜置5 min后加入10 mL甲醇（含2%甲酸）渦旋10 min，加入3.0 g氯化鈉至提取溶液然后再渦旋10 min，離心后取上層溶液3 mL至裝有150 mg無(wú)水硫酸鎂，50 mg PSA和50 mg C18凈化試劑的試管中。渦旋5 min后離心，取上層溶液至干凈試管中氮吹至干，加入200 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶后待測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel（2013版）進(jìn)行處理計(jì)算，色譜優(yōu)化結(jié)果采用Origin 9.1作圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件確定

用體積分?jǐn)?shù)2%甲酸溶液、水、甲醇、2%甲酸-甲醇溶液、乙腈5種常見(jiàn)提取溶劑，分別超聲提取處理，與QuEChERS方法提取處理比較，然后按色譜、質(zhì)譜條件測(cè)定，以測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2%甲酸溶液和水提取后，很難吹干濃縮，樣品檢測(cè)結(jié)果小于定量限無(wú)法準(zhǔn)確定量。

其余包括QuEChERS方法，檢測(cè)結(jié)果在線性范圍內(nèi)，以測(cè)定結(jié)果回收率評(píng)價(jià)，QuEChERS提取測(cè)定回收率最高（圖1），同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)影響程度最小，綜合評(píng)價(jià)，最終選定QuEChERS方法。

圖1 不同提取方法回收率測(cè)定結(jié)果Fig.1 Effect of extraction methods on recoveries of eight nicotine compounds

2.2 色譜質(zhì)譜條件確定

首先考察T3色譜柱，在等度洗脫條件下的結(jié)果，以乙腈為流動(dòng)相B，A相為水相，考察A相體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%和80%條件下8種目標(biāo)物的保留情況，通過(guò)增加水相的初始濃度，二烯煙堿和2,3-聯(lián)吡啶的保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，保留能力逐漸增加，但是其他6種目標(biāo)物的保留能力沒(méi)有明顯增加。8種物質(zhì)未能完全分離。

更換為HILIC色譜柱，以等度洗脫條件，A為乙腈，B為水相，考察體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%和50%條件下目標(biāo)物的保留能力，與T3色譜柱等度洗脫相比較，在初始水相為10%以上，隨著水相比例增大，大部分目標(biāo)物有所保留，目標(biāo)峰保留效果有所改善，最終選擇親水性的HILIC色譜柱，參考文獻(xiàn)[19,25,31]選擇定性定量離子，建立MRM方法，每種化合物選擇1 個(gè)定量離子和1 個(gè)定性離子。每種化合物的保留時(shí)間及定量、定性離子和碰撞能量見(jiàn)表1，不同標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同煙堿類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子色譜圖Fig.2 Selective ion chromatograms of eight nicotine standards

表1 MRM的優(yōu)化條件Table 1 Optimized conditions for multi-reaction ion monitoring

2.3 線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

將系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線并列出校準(zhǔn)曲線的線性方程和線性范圍。如表2所示，本法線性范圍較寬，在3 個(gè)數(shù)量級(jí)以上，線性相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99。

取上述1 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.2 mL加入到0.5 g空白基質(zhì)中，按照1.3.4節(jié)同法處理，逐級(jí)稀釋?zhuān)^(guò)濾膜進(jìn)行分析得出8種化合物的檢出信號(hào)，以信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的檢出量為定量限，信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的檢出量為檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。定量限及檢出限較低，檢出限為0.004～0.04 μg/kg，定量限在0.012～0.12 μg/kg之間，完全滿(mǎn)足食用菌內(nèi)煙堿類(lèi)化合物測(cè)定的量值范圍和最低檢出量。

表2 煙堿類(lèi)化合物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of each nicotine compound

2.4 準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

按照樣品處理方法，分別在基質(zhì)中加入3 個(gè)水平8種成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，配制低（0.5 μg/kg）、中（2 μg/kg）、高含量（10 μg/kg）供試品溶液，各含量平行配制6 份，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。8種煙堿類(lèi)化合物的回收率在78.7%～107.8%之間，說(shuō)明本法準(zhǔn)確度高。

表3 煙堿類(lèi)化合物加標(biāo)回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度（n =6）Table 3 Spiked recoveries, matrix effect and precision of each nicotine compound (n = 6)

按照樣品處理方法，分別在基質(zhì)中加入8種成分3 個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，配制低（0.5 μg/kg）、中（2 μg/kg）、高含量（10 μg/kg）供試品溶液，每個(gè)水平平行配制6 份樣品，分別于當(dāng)日連續(xù)測(cè)定3 次和3 d內(nèi)分別測(cè)定，代入當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。本法的日內(nèi)精密度為1.8%～10.3%，日間精密度在2.8%～11.1%之間。本法基質(zhì)效應(yīng)在81.5%～106.6%之間，說(shuō)明用本方法處理的樣品溶液在本儀器上測(cè)定，基質(zhì)效應(yīng)很小。

2.5 樣品測(cè)定

隨機(jī)抽取5 份市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的銀耳等5種食用菌，按照本實(shí)驗(yàn)建立的QuEChERS方法處理后，采用本實(shí)驗(yàn)所建立方法檢測(cè)，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。5種食用菌中能檢出除去氫煙堿外7種煙堿類(lèi)化合物，本研究所建立方法完全能夠滿(mǎn)足真實(shí)樣品的測(cè)定。食用菌樣品中含量最高的為黑木耳中尼古?。ǎ?0.301±0.634）μg/kg）。目前尚未有食用菌中8種煙堿類(lèi)化合物成分的檢測(cè)報(bào)道，只有研究測(cè)定部分食用菌中尼古丁含量，有報(bào)道牛肝菌中尼古丁含量為0.038～1.011 mg/kg，羊肚菌中尼古丁含量為0.009～0.561 mg/kg，姬松茸中尼古丁含量為0.011～0.725 mg/kg，松茸中尼古丁含量為0.002～0.216 mg/kg[20]。本研究測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本在相同水平范圍內(nèi)。

3 討論與結(jié)論

色譜條件優(yōu)化時(shí)，比較水-乙腈流動(dòng)相梯度洗脫和50%～10%起始不同梯度等度洗脫，觀察目標(biāo)峰分離程度，最終選擇本實(shí)驗(yàn)的等度洗脫條件。

本實(shí)驗(yàn)建立檢測(cè)食用菌中8種煙堿類(lèi)物質(zhì)的QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，定量限和檢出限分別在0.012～0.12 μg/kg和0.004～0.04 μg/kg之間，8種煙堿類(lèi)化合物的回收率在78.7%～107.8%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.8%～10.3%和2.8%～11.1%，符合殘留分析要求。本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏、分析時(shí)間短，完全滿(mǎn)足對(duì)食用菌中尼古丁等內(nèi)源性物質(zhì)的檢測(cè)。

目前鮮見(jiàn)同時(shí)檢測(cè)食用菌中8種煙堿類(lèi)化合物的報(bào)道，并且無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種生物堿[23,31]，本實(shí)驗(yàn)建立了能夠同時(shí)檢測(cè)食用菌中8種煙堿類(lèi)生物堿的方法，經(jīng)5種食用菌檢測(cè)驗(yàn)證，完全能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需求。文獻(xiàn)報(bào)道的食用菌中煙堿類(lèi)含量與本方法檢測(cè)結(jié)果相近。QuEChERS-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)目前逐步應(yīng)用于食品微量物質(zhì)檢測(cè)，本方法克服了分光光度法、液相色譜紫外檢測(cè)器、毛細(xì)管電泳檢測(cè)過(guò)程繁瑣、準(zhǔn)確度差、檢出限不能滿(mǎn)足需求的缺點(diǎn)，既簡(jiǎn)化了前處理步驟，又在保證準(zhǔn)確度的前提下，提高了靈敏度和專(zhuān)屬性。