銅、碘摻雜碳點過氧化物模擬酶比色探針檢測茶葉中痕量Pb(II)

程春生，楊德志，李 宏，李秋蘭，楊亞玲,

（1.昆明理工大學食品科學與工程學院，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500；3.云南省農業科學院農產品加工研究所，云南 昆明 650032）

茶是我國重要經濟作物及健康飲料，茶葉中富含茶多酚、多糖、咖啡因等多種活性物質[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[1-2]。茶葉的重金屬污染問題嚴重影響了茶葉的品質，同時也影響了茶產業的健康發展[3]。由于重金屬能使人體中的蛋白質變性，以鉛為代表的重金屬，超過一定濃度會對人體產生一定危害[4]。隨著人們環保觀念的提升，對茶葉等作物中鉛含量的測定也越來越受到重視[5]，如GB 2762—2017《食品中污染物限量》[6]中規定茶葉中鉛含量不大于5 mg/kg，DB 440300/T 22—2002《無公害茶葉》也規定茶葉鉛含量不大于2 mg/kg[7]。目前，鉛的測定方法主要包括原子吸收法[8]、原子熒光法[9]、電感耦合等離子體質譜[10]、電化學法及比色探針法[11-12]。其中比色探針法由于操作簡單、快速、不需要復雜儀器設備而備受關注[13]。為了實現Pb(II)的超靈敏度測定，研究通常需要信號放大才能獲得良好的靈敏度和低的檢測限。

天然酶屬于一類兼有專一性和高效性的生物催化劑，具有很大的擴展分析潛力，但天然過氧化物酶容易受到傳感條件的影響，在較寬的溫度和pH值范圍內不能保持較高的催化活性[14]。納米酶作為一類新型的模擬酶，它具有許多其他傳統模擬酶所無法企及的優點[15]，人們可以根據納米材料模擬酶的特性，進行研究并加以利用，使納米酶具有更大的應用前景。碳點（carbon dots，CDs）是一種尺寸小于10 nm的新型碳納米材料，其表面可以修飾不同的官能團[16]。已報道其在過氧化物模擬酶研究中具有很好的前景，特別是金屬摻雜CDs[17]?；诮饘俚目勺儍r態，金屬摻雜CDs表現出更優異的過氧化物模擬酶活性。

本研究報道一種通過Pb(II)調節銅、碘摻雜CDs（Cu, I-CDs）過氧化物模擬酶活性，增強比色探針信號測定茶葉中Pb(II)的新方法，如圖1所示。由于Cu, I-CDs在酸性條件下催化H2O2產生羥自由基，進一步氧化底物3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）生成藍色氧化型TMB（oxidized TMB，oxTMB），Pb(II)存在增強了TMB的氧化，由此建立茶葉中痕量Pb(II)的比色探針檢測方法。該方法具有較強的抗干擾能力，共存的其他金屬離子及陰離子沒有干擾，可用于茶葉中Pb(II)的測定。

圖1 基于促進Cu, I-CDs催化活性的Pb(II)檢測比色傳感器示意圖Fig.1 Schematic illustration of the colorimetric sensor for Pb(II)detection based on its ability to promote the catalytic activity of Cu, I-CDs

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化銅（純度98%）、3-碘-L-酪氨酸（純度99%）國藥集團化學試劑有限公司；TMB（純度98%） 美國Sigma-Aldrich公司；H2O2溶液（30%） 衡陽市凱信化工試劑有限公司；Pb元素標準溶液（100 μg/mL）國家有色金屬及電子材料分析測試中心；所用試劑均為分析純，實驗用水均為去離子水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Tecnai G2 TF30場發射透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司；X射線衍射儀、TENsoR27型傅里葉紅外光譜分析儀德國Bruker公司；XW-800快速混勻器 上海汗諾儀器有限公司；AA2800石墨爐原子吸收光譜儀 美國安捷倫科技有限公司；HC-3018R型高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；120 mL聚四氟乙烯內襯水熱反應釜 上海-凱實驗儀器有限公司；pHS-3B精密酸度計德國賽多利司公司；AB204-S電子分析天平 美國梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu, I-CDs的合成

分別準確稱取1.6 g CuCl2、0.4 g 3-碘-L-酪氨酸溶于20 mL超純水中，超聲10 min使其混合均勻，將溶液轉移至聚四氟乙烯內襯水熱反應釜中，于180 ℃恒溫加熱8 h，反應完成后自然冷卻至室溫，得棕色溶液。將所得溶液過0.22 μm濾膜以除去大顆粒雜質，再經10 000 r/min高速離心15 min，得到Cu, I-CDs，并于4 ℃下貯存備用。

1.3.2 比色探針測定Pb(II)

在EP管中依次加入65 μL Cu, I-CDs、50 μL 10 mmol/L H2O2溶液和25 μL 150 mmol/L TMB溶液，一定質量濃度的Pb(II)標準溶液，2 mL pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分混勻，室溫孵育30 min后吸收光譜掃描，以波長654 nm的吸光度進行定量。設定ΔA=A－A0，A為加入Pb(II)后溶液的吸光度；A0為未加入Pb(II)空白時溶液的吸光度。

1.3.3 Cu, I-CDs的催化機制分析

為了揭示Cu, I-CDs作為過氧化物模擬酶與底物的催化過程，在65 μL Cu, I-CDs（35 μg/mL）和2 mL pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入不同濃度的H2O2。充分混勻，室溫孵育30 min后在波長654 nm的位置進行吸光度測定。典型的米氏方程模型：1/V=（Km/Vmax）（1/[S]）＋1/Km。V為反應速率/（mol/（L·s））；Km為米氏常數/（mmol/L）；Vmax為最大反應速率/（mol/（L·s））；[S]為底物H2O2濃度/（mmol/L）。

為明晰Pb(II)的增敏機制，以65 μL不同濃度的Cu, I-CDs加到50 μL 10 mmol/L H2O2和25 μL 150 mmol/L TMB溶液中，然后加入不同濃度的Pb(II)，充分混勻，測定吸光度。

1.3.4 樣品的消解及Pb(II)的測定

稱取茶葉樣品0.500 0 g，置于100 mL錐形瓶中，加硝酸10 mL、高氯酸0.5 mL，置于電熱板上加熱消解。若消化液呈棕褐色，再加少量硝酸，消化至冒白煙，消化液呈無色透明或略帶黃色。冷卻后，用水將試樣溶液轉入50 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻待測。按照同一方法做空白實驗。Pb(II)測定按照1.3.2節方法進行，同時通過GB 5009.12—2017《食品中鉛的測定》方法測定以驗證研究方法的可行性。

2 結果與分析

2.1 Cu, I-CDs模擬酶的表征

從圖2A可以看出，所制備的Cu, I-CDs呈現類球形，分散性較好，且尺寸大約為3～5 nm。如圖2B所示，3 445 cm－1位置的峰歸屬于O—H和N—H的伸縮振動，1 632、l 466 cm－1處的峰為C＝O和C—N的振動特征峰，1 175、1 058 cm－1處的峰分別歸屬于C—N、C—O的伸縮振動[18-20]。此外，在529 cm－1位置看到C—I的拉伸振動峰[21]。C—I鍵進一步證明了所制備的CDs中含有碘元素。從以上分析可以得出，Cu, I-CDs表面存在氨基、羧基和其他親水官能團，導致Cu, I-CDs的水溶性及穩定性較強。從圖2C可以看出，在2θ為25.2°處出現一個較為明顯的衍射峰，對應于石墨的（002）層面，說明Cu, I-CDs包含類石墨烯結構[22-23]。從圖2D可以看到，6 個不同的特征峰，分別為C1s、N1s、O1s、Cu LMM、I3d5和Cu2p[24]，表明該材料存在C、N、O、Cu和I元素，這與圖2B的檢測結果一致。上述表征結果說明，通過水熱法制備的Cu, I-CDs材料較為成功。

圖2 Cu, I-CDs的表征分析Fig.2 Characterization of Cu, I-CDs

2.2 比色探針測定Pb(II)的原理

如圖3A所示，Cu, I-CDs對TMB的氧化能力稍弱，再加入Pb(II)后其氧化能力顯著提高。此外，單獨Pb(II)或加入H2O2對TMB幾乎沒有氧化效果。上述結果表明Cu, I-CDs對H2O2介導的TMB氧化反應具有一定催化作用；當Cu, I-CDs與Pb(II)同時加入H2O2-TMB溶液時，體系的吸光度進一步升高，且隨著Pb(II)濃度的增加而逐漸上升。在波長654 nm處，溶液的吸光度及溶液顏色加深程度隨Pb(II)濃度增加而增加，且呈現一定的線性關系（圖3B）。因此，可以用此吸光度變化的方法實現對Pb(II)的檢測。

圖3 Pb(II)測定的機理Fig.3 Mechanism of Pb(II) determination

羥自由基可以與苯甲酸反應生成羥基苯甲酸，其在激發波長為330 nm時會產生熒光[25]。為了驗證研究體系中羥自由基的產生，分別使用苯甲酸捕捉Pb(II)＋H2O2、Cu, I-CDs＋H2O2和Cu, I-CDs＋Pb(II)＋H2O2體系中產生的羥自由基。結果如圖3C所示，Pb(II)＋H2O2體系中幾乎無羥自由基產生，而Cu, I-CDs＋H2O2和Cu, I-CDs＋Pb(II)＋H2O2體系中則產生了一定量的羥自由基，因此單獨使用Pb(II)無法催化氧化TMB。此外，在加入Pb(II)到體系中后，羥自由基含量明顯增加。有研究表明，Pb(II)和Hg(II)等重金屬，在一定程度上可吸附在模擬酶表面，從而改變模擬酶表面的性質，從而提升模擬酶的穩定性和催化效果[26]。上述研究結果表明，在Cu, I-CDs＋H2O2體系中加入Pb(II)可有效促進藍色oxTMB的生成。

2.3 比色探針測定Pb(II)的條件優化

2.3.1 溶液pH值對體系的影響

一般天然納米酶在酸性環境下會表現出較強的催化活性。為了獲得比色探針高靈敏測定Pb(II)的最優pH值，實驗選用0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作為緩沖體系，考察緩沖溶液pH值的影響。如圖4所示，緩沖溶液pH值在4.0～5.0范圍內，Pb(II)對Cu, I-CDs過氧化物模擬酶活性有明顯增強作用，在pH 4.0時催化氧化TMB效果最佳。因此，研究選用pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

圖4 溶液pH值對反應體系的影響Fig.4 Effect of pH on the reaction system

2.3.2 底物含量對體系的影響

H2O2在Cu, I-CDs過氧化物模擬酶的催化作用下，能產生羥自由基，其又能進一步氧化TMB產生藍色oxTMB，因此底物的加入量對Cu, I-CDs過氧化物模擬酶活性有很大影響。如圖5A所示，H2O2用量在10～70 μmol/L時，吸光度迅速增加，說明足量的H2O2能促使體系氧化反應更完全；H2O2用量在50～70 μmol/L時，吸光度反而下降，可能是因為過量H2O2使生成的產物進一步氧化，導致吸光度下降。如圖5B所示，TMB用量在10～30 μmol/L時，吸光度增加幅度較大；TMB用量在30～50 μmol/L時，吸光度基本平緩但有逐漸下降的趨勢，可能是因為在一定量H2O2存在下，過量的TMB不能被H2O2完全氧化，背景值卻逐漸增高，因而，體系的吸光度逐漸降低。因此，本實驗分別將H2O2和TMB用量定為50 μmol/L和30 μmol/L。

圖5 H2O2濃度（A）和TMB濃度（B）對反應體系的影響Fig.5 Effects of H2O2 concentration (A) and TMB concentration (B)on the reaction system

2.3.3 反應溫度及時間的影響

如圖6所示，在室溫（25 ℃）下，反應10 min，吸光度即基本保持穩定，因此本實驗選擇室溫（25 ℃）下反應10 min。

圖6 反應溫度與時間對反應體系的影響Fig.6 Effects of reaction temperature and time on the reaction system

2.4 Cu, I-CDs過氧化物酶活性的動力學分析

為了揭示Cu, I-CDs作為過氧化物模擬酶與底物的催化過程，研究進行了Cu, I-CDs的酶促反應動力學研究。由圖7A可知，在適宜條件下，Cu, I-CDs催化底物H2O2-TMB反應與典型的米氏動力學方程相符合，催化反應隨H2O2底物濃度的增加明顯增加[27-28]。表明Cu, I-CDs可能先與底物H2O2反應產生羥自由基，進一步氧化底物TMB生成藍色oxTMB。并用雙倒數法[29-30]計算獲得米氏常數Km和最大反應速率Vmax（圖7B），見表1。結果表明：Cu, I-CDs對H2O2，其動力學參數Km及Vmax都比辣根過氧化物酶高，展示了更高的酶活性。并且Cu, I-CDs＋Pb(II)展現出更好的催化活性。

圖7 Cu, I-CDs過氧化物酶活性的動力學分析Fig.7 Kinetic analysis of peroxidase-like activity of Cu, I-CDs

表1 以H2O2為底物的米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）的比較Table 1 Comparison of Michaelis-Menten constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) with H2O2 as the substrate

2.5 線性范圍、檢出限和精密度

在優化后的實驗條件下，按1.3.2節方法，加入不同濃度Pb(II)標準液。隨著Pb(II)質量濃度增加，溶液顏色逐漸加深（圖3B，插圖），在波長654 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，Pb(II)質量濃度在0.27～27.02 mg/L范圍內呈現較好的線性關系，相關系數（R2）為0.989 6，檢出限為34.3 μg/L。

2.6 比色探針對Pb(II)測定的選擇性

考察茶葉樣品中可能存在的共存離子對比色探針體系的影響。如圖8所示，在Pb(II)質量濃度為0.27 mg/L時，分別加入100 倍質量濃度的K＋、Na＋、Cl－；50 倍的Mg2＋、Zn2＋、Ca2＋、Cd2＋、Al3＋、Cu2＋、Fe3＋、NO3－、SO42－、NH4＋；2 倍的Hg2＋、Ag＋。研究結果表明，其他共存離子幾乎不會對體系催化oxTMB產生影響，因而測定結果也不存在干擾。上述結果表明，該方法具有良好的選擇性和抗干擾效果，可選擇性用于Pb(II)的測定。

圖8 共存離子對比色探針體系的影響Fig.8 Effects of coexisting ions on the colorimetric probe system

2.7 茶葉樣品的測定

先按1.3.4節的濕法消解方法，分別處理并檢測了6 個茶葉樣品并根據茶葉標準樣品（GBW10016和GBW10052）中Pb(II)的濃度進行加標實驗。在最優條件下，樣品測定結果見表2。結果表明，只有2 個茶葉樣品中檢出Pb(II)，其余樣品均未檢出，且樣品的加標回收率在92.41%～101.85%范圍內。該研究結果符合GB 5009.12—2017《食品中鉛的測定》要求的精密度，本研究測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于4.47%，表明用本法測定茶葉中Pb(II)結果精密度高、穩定性好。此外，為了驗證所建立方法的可靠性，同時用GB 5009.12—2017中石墨爐原子吸收光譜法進行Pb含量測定，2種方法檢測表明，二者檢測結果較為一致，說明所建立方法的準確度高。

表2 茶葉樣品中Pb(II)含量的測定結果（n=6）Table 2 Recoveries and precision of Pb(II) in actual tea samples (n = 6)

3 結 論

本研究建立了一種基于CDs的過氧化物模擬酶的比色探針測定Pb(II)的方法。先以水熱法制備Cu, I-CDs模擬酶材料，其可以催化H2O2產生羥自由基，因而可以進一步氧化TMB生成藍色oxTMB。Pb(II)的存在，可以促進Cu，I-CDs模擬酶催化氧化TMB，產生顏色更深的oxTMB。結果表明，該反應體系對Pb(II)有非常好的選擇性，抗干擾性強。在最優條件下，Pb(II)檢出限可以達到34.3 μg/L。實際樣品測定結果也表明，該研究方法的回收率較高（92.41%～101.85%），準確性好，抗干擾能力強，可用于茶葉中Pb(II)含量的測定。此外，該研究也進一步證明Pb(II)有利于提升模擬酶的催化效果，但其提升模擬酶催化性能的機制還有待進一步研究。