SFC-Q-TOF-MS法鑒定4種家畜乳甘油三酯及特征分析

劉宇婷，王越男，郭 軍,，郭保民，米智慧

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.內蒙古迪安豐信醫療科技有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 010091）

三酰基甘油（triacylglycerols，TAGs）即甘油三酯，是乳中含量最高的脂類，占總脂肪的98%以上，其組成影響乳及乳制品的物理性質和營養價值[1]。對乳脂TAGs組成進行分析是一項非常具有挑戰性的工作，乳脂是自然界中脂類成分最復雜的物質[2]，其脂肪酸組成及含量極易受到產乳動物的品種、泌乳期、季節、地域和飼料等多種因素的決定或影響[3]，且甘油骨架上存在多種脂肪酸組合形式，因此會產生大量的TAGs種類[4]，另外TAGs研究缺乏種類齊全的理想標準物質[2]，這些都對TAGs分離和鑒定帶來很大難度。近年來超臨界流體色譜等新型色譜分離技術和多維質譜等檢測鑒定技術的迅速發展，使越來越多研究者開始關注母乳脂肪、血脂及其他油脂TAGs的構成和特征研究[5-7]。

目前TAGs的常用分離方法有高溫氣相色譜法[8]、反相高效液相色譜法[9]、銀離子高效液相色譜法[6]和二維液相色譜法[10]，與質譜儀聯用實現TAGs的鑒定和含量測定。這些色譜-質譜聯用方法都有準確分析TAGs的潛力，但也存在明顯的局限性，如操作繁瑣、分辨率差和分析周期長等缺點[11-12]。超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography，SFC）兼有液相色譜和氣相色譜的優點，具有綠色、低成本、分離速度快和分辨率高等優勢，特別適合非極性和低極性化合物的分析。SFC一般采用超臨界流體CO2作為流動相，其溶解能力類似于液相色譜的液體流動相，而其黏度和擴散性則與氣相色譜載氣相似，更有利于傳質，不需要過高的溫度即可實現分離[13]。CO2作為流動相廉價且無毒，節省了廢液處理環節，極大的節省了科研成本，保護環境和實驗人員的健康[14-15]。SFC與四極桿飛行時間質譜（quadruple timeof-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）聯用則無需標準品，利用質譜提供的準確質量數據和特征碎片離子即可進行分子結構分析，具有靈敏度高、穩定性高和重復性好等優點，但目前在TAGs分析中應用報道還較少[16-17]。

本研究旨在探明我國常見荷斯坦牛、山羊、蒙古馬和雙峰駝乳的TAGs種類和構成特征，以期為乳品營養成分數據庫提供有參考價值的數據，為家畜乳TAGs角度營養評價，以及乳的物種、飼養方式、產地和加工方式真實性判別和鑒定研究做前期工作和提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

原乳樣品共采集31 份，其中荷斯坦牛乳6 份（即黑白花牛乳，采自內蒙古巴彥淖爾市圣牧乳業6 個牧場），山羊乳5 份（采自內蒙古鄂爾多斯市烏審旗2 個嘎查），馬乳10 份（采自內蒙古錫林郭勒盟、呼倫貝爾市鄂溫克旗和鄂爾多斯市烏審旗5 家牧戶），雙峰駝10 份（采自內蒙古呼倫貝爾草原和阿拉善左旗巴彥浩特2 家牧戶）。原乳樣品采集后現場液氮冷卻，放于－18 ℃以下冰柜中冷凍保藏，測定時在室溫環境下解凍和均質后取樣檢測。

1.2 試劑與儀器

甲醇、乙腈（均為質譜純），正己烷、甲酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；高純二氧化碳（純度≥99.999%） 北京如源如泉科技有限公司。

Xevo?G2-S SFC-Q-TOF-MS聯用儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 TAGs的提取

準確量取100 μL乳樣于10 mL塑料離心管中，再加入2 mL正己烷萃取劑，室溫條件下渦旋離心2 min，之后8 000 r/min離心10 min，靜置分層，吸取約1 mL上清液，過0.22 μm尼龍濾膜至進樣瓶中待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Acquity UPC2BEH-2EP（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；流動相：A相為超臨界CO2，B相為甲醇-乙腈-甲酸溶液（50∶50∶0.2，V/V）。梯度洗脫：0～2 min，99.9% A、0.1% B；2～6 min，99.9%～99% A、0.1%～1% B；6～9 min，99%～98% A、1%～2% B；9～15 min，98% A、2% B；15～20 min，98%～93% A、2%～7% B；20～24 min，93%～80% A、7%～20% B；24～24.5 min，80%～99.9% A、20%～0.1% B；流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；柱溫50 ℃；背壓1 700 psi。

1.3.3 質譜條件

電噴霧電離源正離子模式，在全信息串聯質譜模式下采集m/z50～2 000范圍內的物質（分析截取m/z400～1 000）；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓25 V；錐孔氣流量20 L/h；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣為氮氣，流量800 L/h；碰撞氣為氬氣；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20～60 eV；數據采集時間共25 min；數據采集軟件為Waters UNIFI。

1.3.4 TAGs的鑒定

質譜分析采用全信息串聯質譜技術，一次進樣可獲得高低能質譜圖，即一次性獲得樣品準分子離子和對應碎片離子的精確質量數據。根據低能模式下獲得的準分子離子峰[M＋NH4]＋的精確質量數初步推斷該分子的相對分子質量，再結合高能模式下獲得的碎片離子[M＋H－FA]＋值識別甘油骨架上結合的3 個脂肪酸，同時依據碎片離子的相對豐度推測占據sn-2位的脂肪酸類型，最終鑒定出TAGs的種類。TAGs根據脂肪酸的簡稱（表1）及其在sn-1、sn-2和sn-3位的排列順序命名，通常認為與sn-1/sn-3位脂肪酸相比，裂解sn-2位脂肪酸需要更多的能量，因此在sn-2位丟失脂肪酸后產生的碎片離子比丟失sn-1/sn-3位脂肪酸產生的碎片離子豐度低，這有利于推斷樣品中TAGs分子的sn-2位脂肪酸，由于非手性方法無法區分sn-1和sn-3的對映異構體，故將其視為相同，命名時按脂肪酸分子質量從大到小排列[10,18-21]。

表1 常見脂肪酸的名稱、簡稱、分子式及相對分子質量信息Table 1 Abbreviations, formulas and relative molecular masses of common fatty acids

1.4 數據整理分析

用儀器自帶Masslynx V4.1軟件采集、形成和分析質譜圖。參數設置：質量窗口：20 mDa；保留時間窗口：0.5 min；強度閾值：10 000 counts；5%峰高的峰寬：1.00 s；除燥程度：6.00。

利用乳脂肪基峰離子色譜（base-peak ion chromatogram，BPI）圖和每個離子色譜峰的低能和高能質譜圖鑒定TAGs分子結構，用BPI圖面積歸一化法計算每一種TAGs的相對含量。所有乳樣鑒定出的TAGs種類和相對含量數據表導入化學計量學軟件Pirouette 4.5（美國Infometrix公司）進行主成分分析（principal component analysis，PCA），觀察4種家畜乳以TAGs聚類的特征，并觀察每一種家畜乳特有的TAGs，快速找到物種共有和特異TAGs，可提升統計比較的效率。

2 結果與分析

2.1 色譜圖

牛、山羊、馬和駱駝乳全部樣品TAGs的BPI見圖1。同物種不同樣品BPI圖形狀一致性較高，且有明顯的物種特異形態。牛乳的色譜峰呈雙駝峰狀分布，出峰時間集中在5～12 min，其他3種動物乳TAGs BPI圖呈單駝峰狀分布。山羊乳的色譜峰數量多且密集，出峰時間集中在4.5～12 min；馬乳的色譜峰豐度逐漸升高，出峰時間集中在6～14 min；駱駝乳的色譜峰數量最少，出峰時間集中在8～12 min。BPI圖提示牛、山羊、馬和駱駝4種家畜乳TAGs分子構成有顯著區別，因此營養生理作用也有所不同，提示家畜乳TAGs指紋的物種鑒別潛力很大。QC樣品的總離子色譜圖保留時間和峰面積重疊情況見圖2，重復性較好。

圖1 牛（a）、山羊（b）、馬（c）和駱駝（d）乳脂肪TAGs基峰離子色譜圖Fig.1 Base-peak ion chromatograms of TAGs in cow (a), goat (b),horse (c) and camel (d) milk fat

圖2 QC樣品的總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of quality control samples

2.2 TAGs的鑒定

根據1.3.4節方法對BPI圖每個峰的高低能質譜圖進行分析，鑒定其分子結構。例如由圖3a可知該準分子離子[M＋NH4]＋的m/z766.907 8，由圖3b可知，豐度高的碎片離子[M＋H－FA]＋的m/z467.537 8、577.683 7和493.560 2；[M＋NH4]＋的質量減去1 個NH4＋的相對分子質量（18），加上1 個H＋的質量，再減去1 個碎片離子的質量即可得到丟失脂肪酸的質量，從而推算出該TAGs分子由油酸（O）、癸酸（C）和棕櫚酸（P）組成，對應的碎片離子為[P－C]＋、[O－P]＋和[O－C]＋。[O－C]＋豐度最低所以棕櫚酸占據sn-2位，油酸質量數大于癸酸，故推測該TAGs分子為O-P-C，分子式為C47H88O6。由于乳中的TAGs成分十分復雜，會有一些共流出物質和同分異構體，導致碎片離子數不止3 個，這給確定TAGs分子構成帶來復雜性和難度。對共流出物質的識別是通過將準分子離子與碎片離子一一對應，將不符合脂肪酸相對分子質量的碎片離子剔除。推算出該分子的脂肪酸構成后會進行反推驗證，甘油的相對分子質量（92）加上推測出的3 個脂肪酸的質量，減去酯化反應脫去3 個H2O分子的質量，再加上1 個NH4＋的質量后需與準分子離子[M＋NH4]＋的質量數一致才能認定為TAGs分子。BPI圖中的1 個峰，也可能有幾種分子質量一樣的TAGs，例如圖4a馬乳樣品中6.95 min流出的物質其準分子離子峰m/z為656.743 7，在圖4b高碰撞能量下準分子離子碎裂形成幾個碎片離子，包括m/z439.488 1、467.524 5、411.446 6、383.407 5、495.557 5，對應的5 個脂肪酸的相對分子質量為200、172、228、256和144，即月桂酸（La）、癸酸（C）、肉豆蔻酸（M）、棕櫚酸（P）和辛酸（Cy），它們能構成La-La-La、P-Cy-La、La-M-C、M-M-Cy和P-C-C 5種TAGs分子。該實驗還分離識別出一部分不同出峰時間的同分異構體對，比如圖5a低能質譜圖在牛乳樣品中7.57 min流出的物質其準分子離子峰m/z為684.819 3，在圖5b高能質譜圖中碎片離子m/z為411.471 5和551.666 9，而在圖5c 7.68 min流出的物質其準分子離子峰m/z684.819 3，在圖5d高能質譜圖中碎片離子m/z383.427 6、411.471 5和579.706 4，經計算這兩個色譜峰為同分異構體P-P-Co和S-Bu-P分子。

圖3 O-P-C TAGs的低能質譜圖（a）和高能質譜圖（b）Fig.3 Mass spectra of TAGs O-P-C under low collision energy (a) and high collision energy (b)

圖4 La-La-La、P-Cy-La、La-M-C、M-M-Cy和P-C-C 5種TAGs低能質譜圖（a）和高能質譜圖（b）Fig.4 Mass spectra of TAGs La-La-La, P-Cy-La, La-M-C, M-M-Cy and P-C-C under low collision energy (a) and high collision energy (b)

圖5 同分異構體P-P-Co和S-Bu-P的質譜圖Fig.5 Mass spectra of isomers of P-P-Co and S-Bu-P

2.3 4種家畜乳TAGs鑒定結果

4種家畜乳鑒定出的TAGs種類和參數匯總結果見表2，具體種類和相對含量（各物種樣品的平均值）結果見表3。共鑒定出145種TAGs，牛、山羊、馬和駱駝乳分別鑒定出60、66、74種和44種TAGs。

表2 4種家畜乳TAGs的匯總結果Table 2 Summary of TAGs in four milks

表3 4種家畜乳TAGs的種類及相對含量Table 3 Types and relative contents of TAGs in four milks

續表3

續表3

4種家畜乳TAGs相對分子質量在470～888之間，酰基碳總鏈數為24～54；駝乳TAGs相對分子質量整體較大，在638～888之間，酰基碳總鏈數也最長，在36～54之間，說明主要有長鏈脂肪酸構成；而山羊乳小分子質量TAGs較多，最低為470，酰基碳總鏈數為24～54，提示有較多中短鏈脂肪酸參與其分子構成。

有14種碳數4～20，雙鍵數0～3的脂肪酸參與了4種家畜乳TAGs的構成。本實驗在牛乳和山羊乳中檢測到的TAGs由12種脂肪酸組成，分別是丁酸（Bu）、己酸（Co）、辛酸（Cy）、癸酸（C）、月桂酸（La）、肉豆蔻酸（M）、十五烷酸（Pe）、棕櫚酸（P）、棕櫚油酸（Po）、硬脂酸（S）、油酸（O）和亞油酸（L），除以上12種脂肪酸外，僅在馬乳和駱駝乳中檢測到由必需脂肪酸亞麻酸（Ln）組成的TAGs，并僅在馬乳中檢測到由二十烯酸（E）組成的TAGs，但未檢測到十五烷酸（Pe）。山羊乳和牛乳的TAGs最多含4 個雙鍵，駱駝乳最多含5 個雙鍵，馬乳最多可含9 個雙鍵。

2.3.1 4種家畜乳TAGs飽和度的比較

根據4種家畜乳TAGs分子的雙鍵數可分成10 組，見圖6。牛乳、山羊乳、馬乳和駱駝乳中多不飽和TAGs相對含量依次為14.12%、8.93%、67.08%和21.5%，單不飽和TAGs相對含量依次為37.55%、34.89%、15.13%和39.6%，飽和TAGs相對含量依次為48.34%、56.18%、17.79%和38.9%。

圖6 不同雙鍵數TAGs在4種家畜乳中相對含量的比較Fig.6 Comparison of relative contents of TAGs with different double bonds in four milks

2.3.2 4種家畜乳中主要的TAGs

4種家畜乳相對含量大于4%的TAGs匯總見表4。在本實驗鑒定出的TAGs分子中發現駱駝乳中的每種TAGs分子至少包含肉豆蔻酸（M）、棕櫚酸（P）、硬脂酸（S）和油酸（O）中的一種，而含量高（≥4%）的幾種TAGs全部由M、P、S和O組成；馬乳中含量高的TAGs都由Ln參與構成；山羊乳中含量高的TAGs都由飽和脂肪酸組成。

表4 4種家畜乳主要的TAGs及其相對含量Table 4 Major TAGs and relative contents in four milks

2.4 PCA

4種家畜乳樣品TAGs的PCA結果見圖7。4種家畜乳在二維空間以物種聚類，距離遠近符合物種分類遠近（圖7a）。同屬牛科的牛和山羊乳樣品聚類共同分布于PC2軸上方，且聚類簇距離最近；馬乳和駱駝乳分別聚類在另兩個區域且相距較遠。由圖7b可知，牛乳的特征TAGs分子為O-Bu-P、P-M-Bu、P-P-Co和P-M-Co；山羊乳的特征TAGs分子為P-P-Bu、P-Co-C、P-Cy-M/P-C-La/M-La-La和O-C-Bu；馬乳的特征TAGs分子為O-C-L、Ln-P-Cy、Ln-P-C、O-P-Ln和Ln-P-Ln；駱駝乳的特征TAGs分子為P-P-M、O-M-P、O-P-P、M-P-S/P-P-P和S-P-P，與表3直接分析統計結果一致，即對TAGs鑒定結果的PCA，有助于快速找到每個物種的特征TAGs，從而提高對比分析效率。PCA結果也能看出，每個物種聚類簇樣品散點比較集中，說明每個物種乳樣雖然來自不同地區或牧場、不同個體，但TAGs種類和構成一致性較高。

圖7 4種家畜乳TAGs特征PCA圖Fig.7 PCA score and root plots of TAGs in four milks

3 討 論

本研究馬乳中不飽和TAGs相對含量高達82.2%，其中必需脂肪酸Ln和L參與構成的TAGs相對含量分別為45.43%和21.05%，國內外鮮見馬乳TAGs的系統研究報道，但馬乳和肉脂肪酸特征研究較多。馬奶原乳和干粉樣品中不飽和脂肪酸（C18:2和C18:3）含量（19%～25%）都比牛乳（2%～4%）高，尤其α-亞麻酸可以作為馬乳的標志性特征[22-23]。人乳脂中也含有較高含量的不飽和脂肪酸（＞50%）[24]，馬乳不飽和脂肪酸比例比牛乳更接近人乳[25]。不飽和脂肪酸對膽固醇代謝有很好效果，可以通過抑制血液中膽固醇沉積和溶解膽固醇結石降低組織和血液膽固醇含量[23]。在一些國家經常用馬乳替代牛乳，為牛乳過敏兒童提供營養[26]。本研究駱駝乳脂肪中所有TAGs分子至少包含肉豆蔻酸（M）、棕櫚酸（P）、硬脂酸（S）和油酸（O）中的一種，而含量高（≥4%）的幾種TAGs全部由M、P、S和O組成，這與Haddad等[27]研究基本一致，其報道駱駝乳99%的TAGs分子至少由M、P、S和O 4種主要脂肪酸中的一種組成。Haddad[27]和Ali[28]等先前還報道C14:0-C16:0-C18:0（M-P-S）和酰基鏈總碳數與雙鍵數為48∶1的TAGs在駱駝乳中最豐富，本研究駝乳M-P-S和O-M-P兩種TAGs含量高達9.59%和8.44%。高希西[18]報道人乳中含量最高的10種TAGs分別是O-P-O、O-P-L、P-O-P、L-P-O、S-P-O、P-L-P、O-O-O、L-P-L、O-L-O和O-M-O，約占人乳TAGs總量的60%[9,18]，其中含量最高的為O-P-O占14.83%。目前提倡嬰幼兒配方乳粉強化O-P-O以使產品的油脂更接近母乳[29]，本研究發現駱駝乳脂肪中O-P-O含量最高，為5.04%，而山羊乳脂肪含量僅為1.8%；而母乳中最豐富的10種TAGs在駱駝乳中同樣最豐富，高達26.07%；郭軍等[30]綜述駝乳脂肪酸的組成與其他反芻動物存在較大差異，而與人乳有很大的相似性，可見駝乳脂肪TAGs更適合在嬰幼兒乳粉中添加。Ali等[28]研究發現山羊奶中己酸（Co）、辛酸（Cy）和癸酸（C）含量較高，由它們參與構成的TAGs也是山羊乳脂中含量最高的組分。本研究中山羊乳含量最高的幾種TAGs均有這3種脂肪酸參與構成，與長鏈脂肪酸相比，中短鏈脂肪酸會優先被腸道吸收[31]。馬乳和駱駝乳營養價值很高，倍受消費者青睞，需求量遠大于產量，因而價格也遠高于牛乳和山羊乳。如何提高產奶量并保障產品品質和真實性是當前值得關注和研究的問題。

本研究發現家畜乳TAGs組成有顯著的物種分類學特征，本研究對4種家畜乳，尤其蒙古馬和雙峰駝等乳脂肪中的TAGs構成進行了較系統的測定和分析，評價了4種常見家畜乳脂肪TAGs的特征，也豐富了家畜乳營養成分數據庫。同時本研究結果提示TAGs指紋有望用于特種家畜乳真實性鑒別。

本研究在利用質譜圖分析鑒定TAGs、4 個物種TAGs比較中結合或引入了聚類分析和分類分析，PCA和軟獨立模式分類效果很好，可直觀觀察物種以TAGs或質譜數據在二維空間聚類特征，并根據根向量圖及聚類貢獻率分析表，可直觀快速確定物種差異TAGs，大大提高了TAGs質譜數據分析通量和鑒定的速度。乳脂肪TAGs及其質譜指紋數據值得深入挖掘和研究，其獨特性有望用于特種家畜乳真實性判別和產品追溯。劉莉敏等[32]報道質譜指紋可用于蜂膠真實性的判別，劉夢靜等[33]報道綿羊肉的脂肪酸指紋與放牧舍飼相關，TAGs指紋應該也能做到，因為TAGs與乳脂肪酸類似，易隨物種、飼養方法、地理環境及氣候條件、年齡和胎次不同而變化，而且TAGs有3 個脂肪酸組合構成，因此TAGs組潛藏著豐富的信息，有待研究和解碼。

4 結 論

本研究采用SFC-Q-TOF-MS法結合PCA對荷斯坦牛、山羊、蒙古馬和雙峰駝乳4種家畜乳的TAGs組成進行鑒定和分析，共鑒定出145種TAGs，其中牛、山羊、馬和駱駝乳分別鑒定出60、66、74種和44種TAGs。4種家畜乳的基峰色譜圖差異明顯。對TAGs進行PCA 4種家畜乳樣品以物種聚類明顯分離，距離遠近符合物種分類遠近。本研究為更全面地認識我國荷斯坦牛、山羊、蒙古馬和雙峰駝乳的TAGs組成特征提供參考，豐富乳營養成分數據，為家畜乳TAGs角度營養評價提供參考，本研究也提示TAGs可用于建模判別家畜乳物種真實性，或可建立模型判別飼養模式和環境。