基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析貴州水豆豉中細(xì)菌多樣性

鄧高文，劉 洋,，李 跑，廖盧艷，尹含靚，蔣立文,，覃業(yè)優(yōu)，肖 何

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410300）

豆豉以大豆為原料，經(jīng)過浸泡、蒸煮、攤涼、制曲、發(fā)酵等一系列工藝制成的一種中國傳統(tǒng)調(diào)味副食品[1-3]。豆豉可分為曲霉型、毛霉型、細(xì)菌型等類型。國內(nèi)一般生產(chǎn)的細(xì)菌型豆豉主要是水豆豉，其中貴州水豆豉是一種地方特色的發(fā)酵豆制品，在貴州、湖南湘西、四川等地以涼拌食用為主。與其他發(fā)酵豆豉相比，產(chǎn)品生產(chǎn)周期較短，氣味特殊，滋味獨(dú)特。水豆豉一般在25～30 ℃進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵微生物以細(xì)菌為主，發(fā)酵后黃豆表面發(fā)白具有黏度絲狀物，經(jīng)過加入含有辣椒面、食鹽及其他香辛料的湯汁后繼續(xù)發(fā)酵成為一種特殊風(fēng)味豆制品。

隨著Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，豆豉微生物菌落多樣性變化被廣泛研究[4-6]。李薇等[7]利用高通測序技術(shù)對制曲階段及后發(fā)酵階段永川毛霉型豆豉曲料中微生物的群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在制曲階段發(fā)揮主導(dǎo)作用的有根霉屬、曲霉屬和芽孢桿菌屬（Bacillus），后發(fā)酵階段微生物菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化較大，但Bacillus具有較穩(wěn)定的相對豐度。趙文鵬等[8]依托高通量測序技術(shù)揭示曲霉型豆豉發(fā)酵中細(xì)菌群落組成和演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬是整個(gè)發(fā)酵過程的核心菌屬，發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的組成變化明顯，還原糖含量、溫度和pH值可能是曲霉型豆豉細(xì)菌群落演替的推動(dòng)因子。而目前對貴州水豆豉微生物的研究主要集中在優(yōu)勢均屬的分離純化，對其發(fā)酵過程中的微生物多樣性變化的相關(guān)研究不多。

本實(shí)驗(yàn)以貴州水豆豉幾個(gè)主要發(fā)酵階段的微生物群落構(gòu)成為研究對象，用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對貴州水豆豉樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化規(guī)律進(jìn)行研究，同時(shí)采用純培養(yǎng)分離鑒定法進(jìn)行關(guān)鍵核心微生物鑒定，以期為貴州水豆豉標(biāo)準(zhǔn)化控制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

貴州水豆豉發(fā)酵過程及后發(fā)酵的坯料，分別是黃豆蒸熟后冷卻到40 ℃后自然控制溫度28～32 ℃之間發(fā)酵24、48 h，以及后發(fā)酵放置24 h的產(chǎn)品（冷開水加入一定比例的干辣椒面、香辛料、12%～15%食鹽，產(chǎn)品最終平衡鹽度8%），取樣編號(hào)分別為DCFW1、DCFW2、DCFW3，來自貴州某企業(yè)。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

甲醛溶液 湖北奧生新材料科技有限公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞溶液Phusion熱啟動(dòng)Flex 2X預(yù)混液（Pusion Hot Start Flex 2X Master Mix） 上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Marker 日本TaKaRa公司；核酸定量分析試劑盒（Qubit dsDNA HS Assay Kit） 美國英杰生命技術(shù)有限公司；Biowest Agarose瓊脂糖G-10 法國Biowest公司；50×TAE 緩沖液 生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPre聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒 美國愛思進(jìn)公司；RStool DNA試劑盒 美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JE 502電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司；LDZX-50 KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD無菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；5424型常溫離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Biocen 22 R冷凍離心機(jī) 德國Wiggens公司；WH-861型旋渦振蕩儀 太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司；DK-8 D型三溫三控恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；A 200型PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；MiSeq測序儀美國Illumina公司；EPS 300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀 上海天能公司；DWHL 388型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；水系微孔濾膜（Φ50 mm，孔徑0.22 μm） 海寧郭店桃園膜分離設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 豆豉16S rDNA高通量測序

1.3.1.1 豆豉樣品總DNA的提取

將貴州水豆豉（DCFW1、DCFW2、DCFW3）攪拌均勻后各取50 g，然后用孔徑為0.22 μm的水系微孔濾膜進(jìn)行抽濾。將抽濾完成后的濾膜剪碎放入微型離心管中，按照R Stool DNA試劑盒說明書提取總DNA。

1.3.1.2 豆豉16S rDNA高通量測序方法

以豆豉總DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)域擴(kuò)增。引物：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。DNA模板50 ng、2×Taqmaster Mix 15 μL，正向和反向引物各1 μL，加入ddH2O定容至30 μL。充分混勻按以下程序進(jìn)行PCR：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，5 個(gè)循環(huán)；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將檢測合格的樣品送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.3.1.3 數(shù)據(jù)分析

對下機(jī)數(shù)據(jù)首先根據(jù)樣品的條形碼信息對數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，再根據(jù)雙端序列的重疊關(guān)系將序列拼接成長的tags，并將序列上建庫引入的條形碼和引物序列去除。為了保證后續(xù)結(jié)果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾去除長度小于100 bp的序列、含不確定堿基達(dá)5%以上的序列及嵌合體序列等低質(zhì)量序列[9]。再以平均鄰近聚類算法通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列劃分為同一個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），挑選代表性序列使用[10]。在核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）中進(jìn)行序列比對，明確序列的分類地位。利用MAFFT（V 7.310）軟件對不同類群優(yōu)勢種群的差異進(jìn)行多序列比對，研究不同OTU間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。同時(shí)，可根據(jù)每個(gè)OTU代表序列與RDP數(shù)據(jù)庫的比對，獲得各樣本的物種注釋結(jié)果，經(jīng)過分類統(tǒng)計(jì)后可得到各分類水平上物種的相對豐度信息。使用Verseach（V2.3.4）計(jì)算樣品的各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)，通過α和β多樣性分析研究單個(gè)樣本中物種多樣性和多個(gè)樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異[11-12]。

1.3.2 發(fā)酵微生物的初步分離鑒定

取貴州水豆豉50 g（均勻取樣）于無菌燒杯中，置于90 ℃水浴鍋中加熱15 min后，取其中25 g作為檢測樣品。在無菌條件下，將檢測樣品25 g用滅菌過的生理鹽水配制10－1～10－10稀釋度的菌液，充分混合均勻[13-14]。采用涂布法分離主要耐熱微生物。將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。對菌落進(jìn)行形態(tài)鑒定，共發(fā)現(xiàn)31 株菌種（1～31），通過革蘭氏染色，共鑒定出9 株，分別命名：3、6、8、9、16、21、23、26、31。同時(shí)采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基對產(chǎn)蛋白酶的微生物進(jìn)行鑒定，并觀察這些菌落的周圍透明圈形成情況，分別測量透明圈和菌落的直徑長短，計(jì)算之后比較比值大小；選取比值較大的菌株按照要求做革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)及鏡檢進(jìn)行初步鑒定，確認(rèn)所篩選菌株為芽孢桿菌后進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，再編號(hào)比較比值大小[15]。

1.3.3 發(fā)酵微生物的鑒定

對酪蛋白培養(yǎng)2 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄計(jì)算，在此基礎(chǔ)上選擇透明圈與單一菌落直徑比值較大的菌落，按照要求進(jìn)行涂片后做革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察，防止在第2次酪蛋白培養(yǎng)之后菌株受到污染而挑錯(cuò)菌的情況發(fā)生。再選取以上所述革蘭氏陽性菌進(jìn)行VITEK MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照生物學(xué)樣品處理基本要求，所有樣品均有4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品。采用SPSS 18.0和Excel 2019進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種不同樣品的OTU統(tǒng)計(jì)及分類學(xué)分析

對測序獲得的296 063 條有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，OTU聚類后3 組樣品中總共得到1 124 個(gè)OTU，根據(jù)3 組樣品中的OTU繪制Venn圖（圖1）。

圖1 3種樣品中的OTU分布圖Fig.1 Venn diagram showing distribution of bacterial OTUs in three douchi samples

由圖1可知，DCFW1中含有782 個(gè)OTU，DCFW2中含有676 個(gè)OTU，DCFW3中含451 個(gè)OTU。說明DCFW1和DCFW2的樣本多樣性較好，這可能是由于DCFW3經(jīng)過后發(fā)酵在食鹽和香辛料等的作用下微生物總數(shù)下降[19]。DCFW1和DCFW2樣品中相同的OTU有530 個(gè)，說明二者微生物種群具有極大的相似性。DCFW3和DCFW2樣品中相同的OTU僅221 個(gè)，這可能是由于拌料時(shí)引入的外界微生物的污染和食鹽的抑菌作用等導(dǎo)致。3種樣品共有的OTU為127 個(gè)，揭示這些微生物在發(fā)酵以及調(diào)味后的水豆豉中一直起重要的作用。

PCA（圖2）表明，PC1和PC2兩主軸解釋度和為89.13%，說明其已能夠反映樣品中大部分的信息，就樣品分布來看DCFW1、DCFW2相距較近，說明兩者菌群結(jié)構(gòu)相似，而DCFW3與DCFW1、DCFW2相距較遠(yuǎn)，說明DCFW3在外界微生物的污染和加鹽等作用下，菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯變化，這與圖1結(jié)果類似。

圖2 PCA結(jié)果Fig.2 PCA plot

2.2 3 個(gè)樣品的物種分類與注釋

將前面的OTU代表序列分別與NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到各個(gè)樣本所有OTU的物種注釋。3 個(gè)樣品門水平的分類圖見圖3。3 個(gè)樣品一共注釋了6 個(gè)門類：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、未知細(xì)菌類（bacteria_unclassified）。厚壁菌門在DCFW1、DCFW2、DCFW3中占絕對優(yōu)勢的菌種。變形菌門在DCFW2中含量最高，DCFW1次之、DCFW3最少。而擬桿菌門只有在DCFW1含有。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長以及食鹽等香辛料的加入，產(chǎn)芽孢的厚壁菌門不斷增加，擬桿菌門、變形菌門等不斷減少。此外，從菌群結(jié)構(gòu)和豐富度看DCFW3與DCFW2和DCFW1差異較大，其中DCFW1含有的門類菌種最多。

芽孢桿菌屬和厚壁菌門是貴州水豆豉主要微生物[20]。由圖3可知，3 個(gè)樣品中的芽孢桿菌屬相對豐度分別為DCFW3（87.8%）＞DCFW2（64.36%）＞DCFW1（32.97%），沙雷氏菌屬（Serratia）可以發(fā)酵并利用麥芽糖，可產(chǎn)氣產(chǎn)色素[21]，但其只存在于DCFW1中（1.31%）。厚壁菌門豐度不斷增加、變形菌門不斷減少，尤其DCFW3階段，可能是拌料加鹽導(dǎo)致。從發(fā)酵各階段的分布看，細(xì)菌多樣性復(fù)雜程度不斷減弱。芽孢桿菌屬隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，豐度不斷增加，雜菌不斷減少，這可能是隨著發(fā)酵曲溫達(dá)到50 ℃左右，適合嗜熱細(xì)菌的生長，而其他一些不耐高溫的微生物則被抑制。變形桿菌屬（Proteus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）豐度也在不斷減少，可能由于拌料時(shí)鹽、香辛料等抑菌成分的加入所導(dǎo)致[22]。因芽孢桿菌屬為貴州水豆豉主要微生物且后期發(fā)酵曲溫較高，因此進(jìn)行耐熱微生物分離鑒定實(shí)驗(yàn)。

圖3 3 個(gè)樣品的門（a）、屬（b）水平分類Fig.3 Bacterial community composition of three douchi samples at the phylum (a) and genus (b) levels

2.3 耐熱微生物分離鑒定結(jié)果

2.3.1 革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)初步鑒定結(jié)果

革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)初步鑒定結(jié)果（圖4）顯示，第1次酪蛋白瓊脂培養(yǎng)后所篩菌株均在革蘭氏染色后均呈紫色，菌體較短且均有芽孢，因此初步判定所檢菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。

圖4 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（×100）Fig.4 Microscopic examination of gram stained-isolates (× 100）

2.3.2 選擇性酪蛋白瓊脂篩選高蛋白酶活性微生物

通過對酪蛋白瓊脂實(shí)驗(yàn)的篩選菌落進(jìn)行質(zhì)地形態(tài)的觀察分析，可知3、9號(hào)，6、21和31號(hào)，8、16、23及28號(hào)各是同一種菌。結(jié)合第2次酪蛋白瓊脂實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值，選擇（2）、（11）、（16）、（28）和（31）號(hào)進(jìn)行VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定。

表1 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)結(jié)果及菌落形態(tài)Table 1 Colonial morphology of isolates cultured on casein agar plates

2.3.3 VITEK MS微生物質(zhì)譜鑒定

經(jīng)VITEK MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定（圖5）表明，（2）、（11）、（16）和（28）號(hào)均有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌4種可能。因該3種菌同屬枯草芽孢桿菌屬，在質(zhì)譜鑒定過程中的生化反應(yīng)比較相似，且目前VITEK系統(tǒng)的鑒定只能達(dá)到屬水平，因此將該結(jié)果結(jié)合菌落形態(tài)分析確定菌株種類[23]。死谷芽孢桿菌一般從土壤中分離得到，因此從水豆豉分離出的可能不大。枯草芽孢桿菌是納豆中主要微生物，屬于水豆豉發(fā)酵的優(yōu)勢菌株。蠟樣芽孢桿菌是致病菌[24]，說明在水豆豉自然發(fā)酵過程中存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 VITEK MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定圖Fig.5 Mass spectra of four strains with high protease activity identified by VITEK MS

3 討 論

豆豉獨(dú)特的感官風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)價(jià)值與參與發(fā)酵的微生物菌群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。由于豆豉制作多采用傳統(tǒng)工藝開放式生產(chǎn)，各地的氣候、原料、發(fā)酵工藝等區(qū)別，從而造就了其極具地方特色的特點(diǎn)。目前，已有研究者利用高通量測序技術(shù)對湖南[25]、江西[26]和甘肅[27-28]等地區(qū)豆豉的微生物多樣性進(jìn)行了分析。然而，作為藥食兩用的貴州水豆豉，其微生物多樣性卻較少被關(guān)注。本研究利用高通量測序技術(shù)結(jié)合分離純化技術(shù)對貴州水豆豉進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。結(jié)果表明：貴州水豆豉細(xì)菌組成較為豐富，主要以厚壁菌門、變形菌門和芽孢桿菌屬為主，含少量短芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬等。與甘肅[27-28]傳統(tǒng)水豆豉樣品厚壁菌門、變形菌門和芽孢桿菌屬均為優(yōu)勢菌種，而江西[26]未檢出，主要以葡萄球菌屬、乳桿菌為主。湖南瀏陽[25]樣品雖以厚壁菌門為主，但真菌更復(fù)雜，有乳桿菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬等。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析貴州水豆豉中細(xì)菌多樣性，同時(shí)結(jié)合貴州水豆豉中耐熱性產(chǎn)蛋白酶微生物進(jìn)行分離鑒定。在3 個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)了在門水平共注釋了6 個(gè)門類，屬水平共分為21 屬類。厚壁菌門和芽孢桿菌屬是占絕對優(yōu)勢的菌，其次是變形菌門和變形桿菌屬。在整個(gè)發(fā)酵時(shí)期芽孢桿菌屬都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長豐度不斷增加。利用VITEK技術(shù)從水豆豉中鑒定出4 株菌，分別為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。其中，蠟樣芽孢桿菌具有致病性，說明在水豆豉自然發(fā)酵過程可能存在一定的安全隱患，還有待進(jìn)一步研究。