駝乳中產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的篩選鑒定及其酶學(xué)特性分析

韓明明，褚宇欣，關(guān) 波，胡有貞，李 谞，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides，GOS）是以乳糖或半乳糖為還原性末端，通過β-糖苷鍵連接一個(gè)或多個(gè)半乳糖單元形成的低聚糖混合物[1]，是一種能調(diào)節(jié)腸道微生物菌群賦予宿主健康益處的益生元[2]。現(xiàn)有研究表明，GOS能促進(jìn)人體腸道中的有益菌（如乳酸菌和雙歧桿菌）最大限度地發(fā)揮其功能，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)[3]，減少腸道疾病的發(fā)病率[4]，延長腎衰竭患者的生命[5]，降低嬰幼兒在遺傳方面的疾病發(fā)生率等[6]。GOS具有模擬人乳寡糖的生理功效，是目前嬰幼兒配方奶粉的重要成分[7]。據(jù)估計(jì)，GOS全球每年消費(fèi)量在20 000 t左右，并以每年10%～20%的比例增長[8]。

GOS獲取途徑目前還十分有限，主要通過酶法合成，利用具有轉(zhuǎn)糖基活性的β-半乳糖苷酶催化乳糖反應(yīng)制得。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23），俗稱乳糖酶，除了具有水解乳糖的功能，還能夠在一定條件下以乳糖作為半乳糖基受體，催化合成具有不同聚合度和糖苷鍵類型的GOS[9]。乳糖濃度、水活度、溫度、pH值等反應(yīng)條件及β-半乳糖苷酶本身的特性均會(huì)影響以乳糖為底物反應(yīng)合成GOS的得率[10]。不同微生物來源的β-半乳糖苷酶對(duì)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)受體的選擇性也存在差異，酶源很大程度上決定了合成GOS產(chǎn)物的聚合度及糖苷鍵類型[5,11]。因此，近些年尋找安全、高效制備GOS的微生物新酶源成為研究熱點(diǎn)[12]。

乳酸菌為公認(rèn)安全（Generally Regarded as Safe，GRAS）菌株，其作為高轉(zhuǎn)糖苷活性β-半乳糖苷酶的產(chǎn)酶菌株具有獨(dú)特優(yōu)勢和價(jià)值[13]。到目前為止，利用乳酸菌β-半乳糖苷酶合成GOS的研究主要集中于Bifidobacteriumspp.、Lactobacillus plantarum、L.reuteri、L.paracasei及L.sakei等[14-18]。L.kefiri相比其他異型乳酸發(fā)酵Lactobacillus類群的來源更為有限，主要從開菲爾粒、啤酒及開菲爾飲料中分離獲得[19]。近年有研究報(bào)道從哈薩克斯坦的駝乳中分離獲得了L.kefiri[20]，但源于L.kefiri的β-半乳糖苷酶合成GOS特性的研究尚未見報(bào)道。L.kefiri作為傳統(tǒng)食品發(fā)酵微生物具有良好的安全性，已被歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）列入安全資格認(rèn)定名錄（Qualified Presumption of Safety，QPS）[21]。此外，L.kefiri具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力，與GOS共同作用能有效抑制Listeria monocytogenes等病原菌的生長[22]，具有良好的益生潛能[23-25]。L.kefiri的這些特性對(duì)于開發(fā)安全、高產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株并應(yīng)用于GOS的合成及開發(fā)合生元產(chǎn)品將具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

本研究從采自新疆沙灣縣的駝乳樣品中篩選獲得1 株產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的L.kefiri菌株，對(duì)其產(chǎn)酶條件、酶學(xué)性質(zhì)及以乳糖為底物合成GOS的反應(yīng)條件及產(chǎn)物成分進(jìn)行分析，旨在為豐富轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶產(chǎn)酶菌株的來源，進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌β-半乳糖苷酶高效合成GOS奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

駝乳和駱駝酸乳均為新疆維吾爾自治區(qū)沙灣縣西戈壁鎮(zhèn)采集。樣品于無菌采樣袋中低溫保存且當(dāng)日運(yùn)回，于冰箱4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，檸檬酸銨2 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，吐溫-80 1 mL/L，瓊脂粉20 g/L，蒸餾水1 000 mL（pH 6.2～6.4），121 ℃滅菌15 min。

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖（X-Gal）、鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，o-NPG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；Silica gel 60 No.553薄層層析（thin layer chromatography，TLC）板 美國默克公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

X-Gal溶液：用二甲基甲酰胺溶解X-Gal配制成20 mg/mL的貯存液，于－20 ℃避光貯存。

o-NPG溶液：將250 mg鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷用80 mL反應(yīng)緩沖溶液溶解，再用100 mL容量瓶搖勻定容，于－20 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

X7酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；LC-10A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、RID-10A示差檢測器 日本島津公司；糖分析柱Hi-Plex Na Column（300 mm×7.7 mm） 美國Agilent公司；TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 英國Techne公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；2Y快速組織細(xì)胞破碎儀 天津歐諾儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品初篩、純化及保藏

在超凈工作臺(tái)中量取等分適量樣品于裝有滅菌生理鹽水的錐形瓶內(nèi)，振蕩搖勻，即10－1的樣品稀釋液。用滅菌生理鹽水的試管梯度稀釋至10－5，分別取100 μL稀釋液（10－3、10－4、10－5）均勻涂布到添加X-Gal以乳糖為碳源的MRS初篩平板上，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，以菌落藍(lán)白色進(jìn)行初篩，挑取藍(lán)色菌落在相同培養(yǎng)條件下純化3 次。初篩菌株分別采用斜面和甘油法保藏。

1.3.2 粗酶液制備及酶活力測定

1.3.2.1 粗酶液制備

參考李琦等[26]的方法，略有修改。挑取活化后平板上的藍(lán)色單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000 r/min冷凍離心收集菌體，用pH 6.5、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液等體積重懸，加入1 mg/mL溶菌酶反應(yīng)3 h，移入含200 μm酸洗玻璃珠的擊打管內(nèi)，細(xì)胞破碎儀擊打（0～4 ℃，擊打48 s，停58 s，共320 s，擊打4 次），8 000 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.3.2.2β-半乳糖苷酶活力及蛋白含量的測定

參考王麗軍等[27]的方法。取50 μLo-NPG（pH 6.5、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液配制）與50 μL粗酶液加入酶標(biāo)板孔中，37 ℃反應(yīng)10 min后加入200 μL 0.5 mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，靜置5 min后，可見明顯黃色，用酶標(biāo)儀測其420 nm波長處的吸光度，計(jì)算酶活力。酶活力單位定義：1 min催化水解o-NPG生成1 μmol鄰硝基苯（o-nitrophenyl，o-NP）消耗的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

蛋白含量測定：參照Bradford法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。取20 μL酶液與200 μL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液加入酶標(biāo)板孔中，室溫下反應(yīng)5 min后，用酶標(biāo)儀測其595 nm波長處的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量（mg）。

比活力為單位質(zhì)量蛋白的酶活力，用U/mg表示。

1.3.3 產(chǎn)酶菌株的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

將篩得菌株接種于MRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至長出單菌落，培養(yǎng)過程對(duì)菌落的色澤、大小、形狀、透明度等特征進(jìn)行觀察記錄。涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對(duì)篩得菌株進(jìn)行鑒定，以糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)和硫化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較其生理生化特性。

1.3.3.2 分子生物學(xué)鑒定

提取產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株基因組DNA，用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果，PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行通用引物27f和1492r的雙向測序，將測序結(jié)果從NCBI-BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析，依據(jù)數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化距離的計(jì)算采用Neighbor-Joining法，在MEGA 6.0軟件中用p-distances和Kimura-2 parameter雙參數(shù)法構(gòu)建，選用Bootstrap法評(píng)價(jià)進(jìn)化樹分支聚類的穩(wěn)定性，重復(fù)1 000 次，得到產(chǎn)酶菌株的種屬分類情況。

1.3.4 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.3.4.1 碳源

將MRS培養(yǎng)基的碳源分別調(diào)整為1 g/100 mL乳糖、1 g/100 mL葡萄糖、0.5 g/100 mL乳糖＋0.5 g/100 mL葡萄糖、2 g/100 mL乳糖、2 g/100 mL葡萄糖、1 g/100 mL乳糖＋1 g/100 mL葡萄糖，37 ℃液體培養(yǎng)24 h，分別測定酶活力。

1.3.4.2 氮源

將MRS培養(yǎng)基的氮源分別調(diào)整為以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、硫酸銨、尿素、蛋白胨＋酵母浸粉（1∶1）、蛋白胨＋牛肉膏（1∶1）、酵母浸粉＋牛肉膏（1∶1）、蛋白胨＋酵母浸粉＋牛肉膏（1∶1∶1）為氮源，總氮源質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，37 ℃液體培養(yǎng)24 h，分別測定酶活力。

1.3.4.3 發(fā)酵初始pH值的影響

選擇最適碳源和氮源，在不同的初始pH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5條件下液體培養(yǎng)后測定酶活力。

1.3.4.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

選擇最適碳源、氮源及初始pH值液體培養(yǎng)，48 h內(nèi)每隔4 h取樣，測定酶活力和菌體生長量（OD600nm）。

1.3.5β-半乳糖苷酶的初步純化

取10 mL粗酶液，在4 ℃冰浴狀態(tài)下，緩慢地加入對(duì)應(yīng)40%飽和度的相應(yīng)量硫酸銨固體并緩慢攪拌，避免蛋白質(zhì)變性產(chǎn)生氣泡，靜置過夜，4 ℃、3 000×g離心30 min，收集沉淀，加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解，于14 kDa透析袋中透析過夜，獲得初步純化的β-半乳糖苷酶。

1.3.6 酶學(xué)特性分析

1.3.6.1 最適反應(yīng)溫度

取初步純化酶液，分別在45、50、55、60、65、70、75 ℃條件下與o-NPG反應(yīng)，測其酶活力。

1.3.6.2 最適反應(yīng)pH值

用不同pH值的磷酸鹽緩沖液分別配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的o-NPG溶液，取初步純化酶液，在最適溫度下分別反應(yīng)，測其酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

用1 mmol/L的NiCl2、MgCl2、BaCl2、KCl、NaCl、AlCl3、CaCl2、FeCl3、FeCl2等金屬離子鹽溶液配制o-NPG溶液，取初步純化酶液，最適溫度下分別反應(yīng)，測其酶活力。

1.3.7 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成GOS條件優(yōu)化

1.3.7.1 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)

50 μL粗酶液與300 μL 30%乳糖溶液40 ℃反應(yīng)12 h，沸水浴滅酶10 min后，取10 μL樣品，用無水乙醇稀釋至1%。

1.3.7.2 乳糖為底物合成GOS的反應(yīng)條件優(yōu)化

取粗酶液50 μL與300 μL乳糖溶液分別在不同初始乳糖質(zhì)量濃度（100、200、300、400、450 g/L）、反應(yīng)溫度（45、50、55、60、65、70、75 ℃）及反應(yīng)時(shí)間（2、4、8、12、24 h）條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，TLC法分析其產(chǎn)物，最終確定乳糖為底物合成GOS的最適反應(yīng)條件。

1.3.8 TLC分析

參考李正義等[28]的方法。將硅膠鋁板烘干活化，將無水乙醇稀釋至1%的樣品混勻，用毛細(xì)管點(diǎn)樣，層析缸中以展開劑（正丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2）展開，完全展開后晾干，噴霧顯色劑于120 ℃烘箱中烘烤20 min顯色。掃描后用軟件ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）對(duì)不同顏色的斑點(diǎn)進(jìn)行初步定量分析。

1.3.9 HPLC分析

參考王麗軍等[27]的方法，稍有修改。用三蒸水將滅酶后的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，0.22 μm濾膜過濾后，使用RID-10A示差檢測器，Hi-Plex Na低聚糖分析柱，三蒸水作流動(dòng)相，流速0.2 mL/min，柱溫80 ℃，進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)行HPLC分析。參考盧麗麗等[29]的方法，根據(jù)HPLC峰面積對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中各糖組分進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酶活力測定均設(shè)置空白對(duì)照，且測定結(jié)果為3 次平行實(shí)驗(yàn)所得。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均使用Excel軟件，采用Origin Pro軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選鑒定

2.1.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

在含X-Gal的MRS平板上初篩得到20 株產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株，初篩菌株的產(chǎn)酶水平見表1。

以液體發(fā)酵制備得到的粗酶液催化30 g/100 mL乳糖溶液反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析（圖1A），GOS斑點(diǎn)灰度掃描半定量結(jié)果如圖1B所示。共篩選獲得轉(zhuǎn)糖基活性較強(qiáng)的β-半乳糖苷酶產(chǎn)酶菌株6 株，其中駱駝酸乳來源1 株（LS2），駝乳來源5 株（L1、L4、L6、L10、L11），選擇生成GOS產(chǎn)物最多的L6菌株開展進(jìn)一步研究。

圖1 復(fù)篩菌株轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物的TLC（A）及GOS灰度定量（B）Fig.1 TLC analysis (A) of transglycosylation reaction products obtained with β-galactosidase from selected strains and gray values of GOS (B)

2.1.2 產(chǎn)酶菌株的鑒定

2.1.2.1 形態(tài)學(xué)及生理生化特性

駝乳及駱駝酸乳來源菌株均能在MRS平板上生成直徑1 mm左右的圓形菌落，菌落顏色為乳白色，革蘭氏染色陽性，駝乳中篩選所得菌株L1～L16為桿狀，駱駝酸乳來源菌株LS1～LS4為鏈球狀。

對(duì)具有明顯轉(zhuǎn)糖基活性的6 株菌L1、L4、L6、L10、L11、LS2進(jìn)行生理生化鑒定結(jié)果見表2。6 株菌均能發(fā)酵乳糖和葡萄糖，均不能發(fā)酵阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖，駝乳來源菌株L1、L4、L6、L10及L11都不能發(fā)酵麥芽糖、甘露糖、木糖和蔗糖，LS2則能發(fā)酵麥芽糖、甘露糖、木糖和蔗糖，6 株菌的明膠液化實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)均為陰性。

表2 產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶菌株的生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of strains producing β-galactosidase with transglycosyl activity

2.1.2.2 分子生物學(xué)分析

對(duì)6 株產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并選擇同源序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示（圖2），篩選菌株L1、L4、L6、L10、L11與開菲爾乳桿菌（L.kefiri）歸為一支，LS2則與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）歸為一支。

圖2 產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of β-galactosidase-producing strains

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響

分析碳源對(duì)L.kefiriL6產(chǎn)酶的影響，分別測定菌液OD600nm及酶活力，結(jié)果見圖3。以2 g/100 mL乳糖為碳源時(shí)，產(chǎn)酶水平最高，為（2.11±0.01）U/mL，表明該β-半乳糖苷酶為誘導(dǎo)酶。

圖3 碳源對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響Fig.3 Effect of carbon source on the production of β-galactosidase

2.2.2 氮源對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響

分析氮源對(duì)L.kefiriL6產(chǎn)酶的影響，分別測定菌液OD600nm及酶活力，結(jié)果見圖4。菌株以蛋白胨和牛肉膏為氮源時(shí)，其產(chǎn)酶水平為（0.58±0.01）U/mL；以蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉為氮源時(shí)，其產(chǎn)酶水平最高，可達(dá)（3.31±0.01）U/mL，表明酵母浸粉為該菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的重要氮源。

圖4 氮源對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on the production of β-galactosidase

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響

為分析培養(yǎng)基初始pH值對(duì)L.kefiriL6產(chǎn)酶的影響，以檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制不同pH值的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別測定菌液OD600nm及酶活力，結(jié)果見圖5。菌體生長量與產(chǎn)酶水平變化趨勢一致，pH 5.5～6.5時(shí)，相對(duì)酶活力均達(dá)90%以上，pH 5.5時(shí)，產(chǎn)酶水平最高，為（2.99±0.02）U/mL。

圖5 發(fā)酵初始pH值對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on the production of β-galactosidase

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響

為得到L.kefiriL6的產(chǎn)酶曲線，將其接種至上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，間隔4 h測定菌液OD600nm及酶活力（圖6）。結(jié)果表明，該菌株在培養(yǎng)20 h產(chǎn)酶水平最高（（3.81±0.02）U/mL），4～20 h培養(yǎng)基中菌體的生長量變化趨勢與產(chǎn)酶趨勢基本一致。20 h以后，菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期，產(chǎn)酶量逐漸降低。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the production of β-galactosidase

2.3 β-半乳糖苷酶的初步純化

L.kefiriL6菌株破碎所得粗酶液經(jīng)飽和度40%硫酸銨初步純化，其純化過程的相關(guān)參數(shù)見表3。硫酸銨初步純化的回收率為70%，比活力可達(dá)142.47 U/mg。

表3 β-半乳糖苷酶的初步純化Table 3 Preliminary purification of β-galactosidase

2.4 酶學(xué)特性分析

2.4.1 pH值對(duì)酶活力影響

如圖7所示，該酶在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)活性較高，相對(duì)酶活力均能保持60%以上，pH 7.0時(shí)，該酶相對(duì)酶活力最高。pH 3.0～4.0時(shí)酶活力基本喪失。

圖7 pH值對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on enzyme activity

2.4.2 溫度對(duì)酶活力影響

如圖8所示，菌株L.kefiriL6所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最適催化溫度為55 ℃，這與王欣等[30]的研究結(jié)論相同。該酶催化反應(yīng)的溫度范圍較寬，45～70 ℃均能保持50%以上相對(duì)酶活力。75 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力降低至20%以下。

圖8 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活力影響

不同金屬離子對(duì)菌株L.kefiriL6所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的酶活力具有較為明顯的影響，結(jié)果如圖9所示。Mg2＋對(duì)該酶有明顯的激活作用，相對(duì)酶活力約為對(duì)照的1.93 倍。Ni2＋、Ca2＋和Al3＋則對(duì)其酶活力有明顯的抑制作用，而其他金屬離子如Na＋、K＋、Ba2＋、Fe2＋、Fe3＋對(duì)其酶活力無明顯影響。

圖9 金屬離子對(duì)酶活力的影響Fig.9 Effect of metal ions on enzyme activity

2.5 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)條件優(yōu)化

2.5.1 乳糖質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的影響

如圖10所示，隨反應(yīng)體系中初始乳糖質(zhì)量濃度增加，GOS得率逐漸增加。當(dāng)初始乳糖質(zhì)量濃度為10 g/100 mL時(shí)，GOS得率僅3.34%（m/m，下同），乳糖殘留量為0.72%（m/m，下同）；初始乳糖質(zhì)量濃度升高至45 g/100 mL時(shí)，GOS得率最高達(dá)17.60%，此時(shí)，乳糖殘留量為14.40%。

圖10 不同初始乳糖質(zhì)量濃度反應(yīng)產(chǎn)物的TLC（A）及GOS、殘留乳糖的HPLC定量分析（B）Fig.10 TLC analysis (A) and HPLC quantification of GOS and residual lactose (B) at different initial lactose concentrations

2.5.2 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)溫度優(yōu)化

以45 g/100 mL的乳糖質(zhì)量濃度，分別在45、50、55、60、65、70、75 ℃進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，TLC分析其產(chǎn)物，結(jié)果見圖11。在45～60 ℃時(shí)，均有水解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物生成；65 ℃時(shí)GOS得率最高，可達(dá)26.12%；反應(yīng)溫度升高至75 ℃，乳糖殘留量增至93.55%，GOS得率急劇降低，僅為6.92%。因此，菌株L.kefiriL6所產(chǎn)β-半乳糖苷酶合成GOS最適反應(yīng)溫度為65 ℃。

圖11 不同溫度轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物的TLC（A）及GOS、殘留乳糖的HPLC定量分析（B）Fig.11 TLC analysis (A) and HPLC quantification of GOS and residual lactose (B) at different reaction temperatures

2.5.3 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)體系中，該酶與乳糖反應(yīng)2 h即有水解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物生成。轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)4 h時(shí)GOS得率最高，可達(dá)31.51%（圖12）。反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長，體系中乳糖殘留量不斷減少，反應(yīng)至24 h，乳糖的水解率達(dá)到64.52%。4 h后，GOS得率逐漸降低，反應(yīng)24 h后，GOS得率僅為20.49%。因此，菌株L.kefiriL6所產(chǎn)β-半乳糖苷酶催化合成GOS的最適反應(yīng)時(shí)間為4 h。

圖12 不同反應(yīng)時(shí)間轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物的TLC（A）及GOS、殘留乳糖的HPLC定量分析（B）Fig.12 TLC analysis (A) and HPLC quantification of GOS and residual lactose (B) after different reaction times

2.6 最優(yōu)反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的組成分析

將乳糖質(zhì)量濃度45 g/100 mL、65 ℃條件下轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)4 h的GOS產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。保留時(shí)間52.040 min的峰為半乳糖，保留時(shí)間48.393 min為葡萄糖，40.612 min為二糖（乳糖和轉(zhuǎn)移二糖未分離），34.530 min為半乳三糖，16.223～30.052 min之間的峰為三糖以上的GOS成分。

根據(jù)圖13各GOS組分對(duì)應(yīng)的HPLC峰面積計(jì)算各GOS組分得率。最適反應(yīng)條件下生成的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物中半乳糖為11.06%，葡萄糖為21.16%，二糖（包括乳糖和轉(zhuǎn)移二糖）為49.78%，轉(zhuǎn)移三糖為13.85%，轉(zhuǎn)移三糖以上的GOS為4.15%。結(jié)合ImageJ對(duì)TLC斑點(diǎn)掃描結(jié)果分析，確定乳糖36.27%，轉(zhuǎn)移二糖為13.51%。綜上，L.kefiriL6催化合成GOS得率為31.51%，酶催化反應(yīng)形成的GOS主要為轉(zhuǎn)移二糖和轉(zhuǎn)移三糖。

圖13 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析Fig.13 HPLC analysis of the transglycosylation reaction products

3 討 論

β-半乳糖苷酶因其來源廣泛，具有乳糖水解和轉(zhuǎn)半乳糖基活性，被廣泛應(yīng)用于乳糖的水解和GOS的合成。一般來說，GOS得率隨著乳糖質(zhì)量濃度的增加而增加，其酶源和反應(yīng)條件（乳糖質(zhì)量濃度、水活度、溫度、pH值等）對(duì)合成的GOS得率和組成有顯著影響[31]。目前合成GOS的商業(yè)化β-半乳糖苷酶制劑主要來源于米曲霉（Aspergillus oryzae）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）和環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）[32]。不同來源的β-半乳糖苷酶其活性存在顯著差異[33]，仍需不斷尋找新酶源以高效合成GOS。

本研究從新疆沙灣縣采集的駝乳樣品中分離篩得6 株高轉(zhuǎn)糖基活性菌株，5 株為駱駝乳來源，1 株為駱駝酸乳來源。其中，L6的產(chǎn)酶水平及轉(zhuǎn)糖基活性均較高，結(jié)合形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)方法將L6菌株鑒定為L.kefiri。L.kefiriL6所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)pH值為7.0，這與已報(bào)道的細(xì)菌來源β-半乳糖苷酶最適pH值一般介于6.0～7.5一致[34]。不同溫度下，酶的催化活性差異顯著[35]，最適溫度高于50 ℃的β-半乳糖苷酶一般被稱為耐熱β-半乳糖苷酶[34]。已報(bào)道的耐熱性較強(qiáng)的β-半乳糖苷酶主要有來源于Bacillus coagulans的β-半乳糖苷酶，其最適反應(yīng)溫度為65 ℃[36]；來源于Thermotoga maritime的β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃[37]；來源于Thermussp.的β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度為85 ℃[38]。L.kefiriL6所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的催化反應(yīng)溫度范圍較寬，該酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，45～70 ℃均能保持50%以上相對(duì)酶活力，溫度高達(dá)75 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力才降至20%以下。因此，該菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶在低乳糖乳品的加工過程中具有良好的應(yīng)用前景。

L.kefiriL6菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶在初始乳糖質(zhì)量濃度為45 g/100 mL、65 ℃反應(yīng)4 h，GOS得率達(dá)到最高，約31.51%，這與Vénica等[39]報(bào)道的達(dá)到最高GOS得率通常需反應(yīng)1～5 h一致。隨著轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)時(shí)間延長，體系中乳糖殘留量不斷減少，反應(yīng)至24 h，乳糖水解率達(dá)到64.52%，這與鄭義等[40]以馬克斯克魯維酵母來源的β-半乳糖苷酶反應(yīng)50 h，得到68.34%的乳糖水解率較相似。4 h后，GOS得率逐漸降低，可能是反應(yīng)體系中底物乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致反應(yīng)更多向水解反應(yīng)方向進(jìn)行[32]。本研究所得GOS得率與已報(bào)道的馬克斯克魯維酵母[40]34.70%的GOS得率和長雙歧桿菌來源β-半乳糖苷酶32.50%的GOS得率[9]接近，但低于王麗軍等[27]報(bào)道的L.plantarumYLBGNL-S7來源β-半乳糖苷酶43.40%的GOS得率，表明菌株的來源可能對(duì)其所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性影響更大。L.kefiriL6菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶在其最佳的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)條件下生成的GOS中，轉(zhuǎn)移二糖約為13.51%，轉(zhuǎn)移三糖約為13.85%，轉(zhuǎn)移三糖以上的GOS約為4.15%；L.plantarumWCFS1[41]來源的β-半乳糖苷酶合成GOS，生成的轉(zhuǎn)移二糖19%、轉(zhuǎn)移三糖21%、轉(zhuǎn)移四糖1.3%；L.plantarumYLBGNL-S7來源的β-半乳糖苷酶合成GOS，轉(zhuǎn)移二糖和轉(zhuǎn)移三糖分別為18.29%和12.95%，轉(zhuǎn)移三糖以上的GOS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.17%，不同來源的β-半乳糖苷酶合成GOS的種類及數(shù)量均存在一定差異[42-44]。

4 結(jié) 論

本研究從新疆沙灣縣駝乳樣品中篩選獲得轉(zhuǎn)糖基活性較高的β-半乳糖苷酶產(chǎn)酶菌株L.kefiriL6。該酶的催化反應(yīng)溫度范圍較寬，最適反應(yīng)溫度為55 ℃，45～70 ℃均能保持50%以上相對(duì)酶活力；以45 g/100 mL乳糖為底物，65 ℃、pH 7.0條件下反應(yīng)4 h生成的轉(zhuǎn)移二糖為13.51%，轉(zhuǎn)移三糖為13.85%，轉(zhuǎn)移三糖以上的GOS為4.15%，該菌株為酶法合成GOS提供了新的乳酸菌酶源。