基于高通量測序分析儲藏稻谷中的真菌群落結構與優勢菌屬

徐圓程，劉 慧，王光宇，吳紅影，邱偉芬

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210023）

稻谷是食用人口最多的作物之一[1]，在中國，有65%的人口以稻米為主食[2]，因此稻谷的安全性就顯得尤為重要。在稻谷儲藏過程中，當溫度、濕度條件達到適合真菌生長條件時，這些真菌便會分解并利用稻谷中營養物質，使其品質發生劣變，這會對糧食安全與糧食品質造成嚴重威脅[3-4]，有些真菌甚至會產生真菌毒素[5]，進而威脅食用者的健康[6]。因此，研究不同溫度和濕度下儲藏稻谷中的真菌菌群結構有重要意義，可以更有針對性地控制儲藏條件，同時也為減少儲藏稻谷霉變發生幾率以及提高儲藏稻谷品質提供理論依據。

傳統方法分析微生物群落多樣性及群落結構需要先對可培養微生物進行分離、鑒定，再進行分析，而在樣品中可培養微生物往往只占總微生物的不到10%[7]，因此，這也就說明了傳統方法不能全面評估微生物群落的組成及結構。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的研究將這一技術運用于食品微生物群落特征的鑒定[8]。劉金等[9]利用高通量測序技術分析了廣西百色地區儲藏油茶籽中霉菌的多樣性，發現油茶籽殼和仁中的污染霉菌主要都為曲霉屬（Aspergillus）和節擔菌屬（Wallemia）。吳進菊等[10]通過高通量測序聚類分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），發現大頭菜在發酵前期的優勢菌屬為明梭孢屬（Monographella），而中、后期的優勢菌屬為德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。衛春會等[11]采用高通量測序比較分析汾酒酒醅發酵過程中的真菌群落結構，結果顯示酒醅發酵初期的優勢菌都是畢赤酵母（Pichia），到發酵后期，兩種酒醅中的優勢菌分別變為釀酒酵母（Saccharomyces）和假絲酵母（Candida）。此外，高通量測序技術作為食品行業一項新興的技術，也已廣泛運用到香腸[12]、酸菜[13]、腐乳[14]、豆豉[15]等的微生物群落分析研究中。但鮮有報道將高通量測序技術運用到系統測定不同溫度、濕度條件下儲藏稻谷的真菌群落結構多樣性研究中。

本研究將湖南衡陽倉儲2017年稻谷在不同溫度（10、20、25、30、40 ℃）和環境相對濕度（relative humidity，RH）（43%、75%和85%）條件下儲藏16 周后，采用高通量測序技術分析不同儲藏條件下樣品中真菌群落結構與優勢菌屬，旨在為調整倉儲條件及對優勢真菌的針對性防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷為湖南衡陽2017年倉儲稻谷。

碳酸鉀、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒美國Axygen公司；DL2000 DNA Marker、2×RapidTaqMaster Mix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；HiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；5810R離心機 德國Eppendorf公司；WH-2微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱 上海三發科學儀器有限公司；電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；移液器、 NanoDrop One超微量分光光度儀美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

參照Wang Xihai等[16]的方法，分別配制飽和碳酸鉀溶液、飽和氯化鈉溶液和飽和氯化鉀溶液，以人工制造43% RH、75% RH和85% RH的環境。在無菌條件下，將50 g稻谷樣品分裝在150 mm無菌培養皿中，一共準備45 份，然后分別將培養皿轉移至盛有不同飽和鹽溶液的干燥器中，接著將干燥器分別放入5種溫度（10、20、25、30、40 ℃）的人工氣候箱內，儲藏16 周后進行后續實驗。

1.3.2 基因組DNA提取及PCR

按照天根生物植物基因組DNA提取試劑盒說明書的步驟，提取稻谷樣品中總DNA，提取的總DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經超微量分光光度計檢測濃度，檢測合格后將DNA樣品保存在－20 ℃。以樣本中微生物總DNA為模板，以通用引物ITS1/ITS2擴增真菌的ITS基因序列[17]。PCR采用25 μL反應體系：總DNA 1 μL，2×RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，添加雙蒸水9.5 μL補充至25 μL。PCR條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共30 個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.3.3 測序過程

檢測合格的樣品構建文庫：回收目的擴增片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的黏性末端修復成平末端，再通過3’端加堿基“A”，使得DNA片段能與3’端帶有“T”堿基的特殊接頭連接，最后，用合格的文庫進行Cluster制備和測序。

1.3.4 數據分析

對于測序結果，首先進行數據處理過濾，獲得Clean Date后進行拆分[18]，之后進行序列拼接得到高變區的Tags[19]。在97%的相似度下進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，得到代表序列；再將Tags與代表序列作比對，得到每個樣品在OTU的豐度分析[20]。得到OTU代表序列之后，將序列與UNITE Version7數據庫進行比對，在置信度閾值為0.6的條件下，對物種進行注釋，并過濾注釋結果。過濾完成后，選擇剩余的OTU進入后續分析。

2 結果與分析

2.1 稻谷真菌測序數據統計

經質控處理和OTU聚類，原始稻谷和儲藏后稻谷中真菌序列統計如表1所示，樣品優化序列占比都達到80%以上，原始稻谷與不同條件儲藏的稻谷，共計48 個樣品中共產生640 個OTU，其中20 ℃、43% RH條件下產生的OTU數量最多，30 ℃、75% RH條件下產生的OTU數量最少。另外還發現，除40 ℃，其他各儲藏溫度下75% RH和85% RH條件下OTU數都少于43% RH，可能是高濕度條件抑制了部分微生物的生長。

表1 原始稻谷及在不同條件下儲藏后稻谷中真菌的序列統計Table 1 Amplification sequence statistics of fungi in fresh rice and rice stored under different conditions

2.2 稻谷真菌群落多樣性分析

Sobs指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數越大，說明菌群豐度和多樣性越大；而Simpson指數越大，則說明稻谷中的真菌群落多樣性越小[21]。覆蓋率可以評估樣品的樣本序列在文庫中的覆蓋程度。由表2可知，所有樣品的覆蓋率都達到0.99以上，表明樣品中序列未被測到的概率較低。在20 ℃、43% RH條件下儲藏后的稻谷Sobs指數、Chao指數和ACE指數均最大，表明在此儲藏條件下的稻谷真菌群落物種的豐富度最大，而30 ℃、75% RH條件下這些指數最低，表明其真菌群落豐富度最小。同時，經比較得出，在10 ℃、85% RH條件下的稻谷樣品Shannon指數最大，Simpson指數最小，表明此儲藏條件下的稻谷真菌群落物種均勻度最高。總體來看，在20 ℃、43% RH條件下儲藏后的稻谷真菌群落多樣性最高，30 ℃、75% RH儲藏條件下稻谷真菌群落物種多樣性最低。由此可見，20 ℃、43% RH的條件適合更多數真菌的生存。

表2 全部稻谷樣品中的真菌群落多樣性指數統計Table 2 Statistics of diversity indexes of fungal community in all rice samples

2.3 稻谷真菌群落組成分析

原始稻谷及在不同條件下儲藏后的稻谷中，去除未分類的真菌群落共包含5 個門，如圖1所示，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）和毛霉門（Mucoromycota）。其中Ascomycota為優勢菌門，相對豐度為2.53%～96.86%；其次為Basidiomycota，相對豐度為0.02%～9.39%。可以看到，原始稻谷樣品中，Ascomycota占比最高，平均占比達57.78%，其次是Basidiomycota 1.58%。當溫度為20、25、30 ℃，相對環境濕度為75% RH和85% RH時，Ascomycota和Basidiomycota豐度處于相對低的水平。

圖1 原始稻谷及不同溫度、濕度條件儲藏后稻谷中真菌門水平相對豐度Fig.1 Relative abundance of fungi at the level of phylum in fresh rice and rice stored under different temperature and humidity conditions

選擇原始稻谷樣品及在不同溫度、濕度條件儲藏后的稻谷樣品測序結果中共有、相對豐度較大的屬水平序列和種水平序列群落，去除測序結果中的unclassified和unidentified，得到稻谷真菌屬水平和種水平的相對豐度圖。由圖2A可知，在原始稻谷樣品中，各菌屬分布較為平均，但主要菌屬是白僵菌屬（Beauveria）、Aspergillus和赤霉屬（Gibberella）。其中在10 ℃儲藏時，稻谷霉菌群落中主要菌屬為Beauveria、黑孢屬（Nigrospora）、Aspergillus、竹黃菌屬（Shiraia）和Wallemia。在20 ℃儲藏時，43% RH下儲藏的稻谷中主要菌屬是Nigrospora、卵球菌屬（Ophiosphaerella）和Gibberella；而75%和85% RH下稻谷主要菌屬是Aspergillus、Beauveria和Candida。在25 ℃儲藏時，稻谷主要菌屬是Beauveria、Aspergillus、Nigrospora、鏈格孢屬（Alternaria）和Candida。在30 ℃儲藏時，稻谷主要菌屬是Aspergillus、Candida、Nigrospora、Gibberella、Ophiosphaerella和Alternaria。在40 ℃儲藏時，43% RH下稻谷主要菌屬是Nigrospora、Beauveria和Alternaria；75%及85% RH下稻谷主要菌屬是Aspergillus、Nigrospora和Beauveria。綜上所述，無論在哪種溫度條件中，75%和85% RH下的優勢菌屬都包含Aspergillus，且隨著溫度的升高，Aspergillus占比也相對變大，這與楊曉蓉等[22]儲藏溫度越高，稻谷含水量越大，越容易發生霉變的研究結果一致。

圖2 原始稻谷及不同溫度、濕度條件儲藏后稻谷中真菌屬水平（A）和種水平（B）的相對豐度Fig.2 Relative abundance of different fungal genera (A) and species (B)in fresh rice and rice stored under different conditions

從種水平看，在10 ℃儲藏時，稻谷中主要菌種是白僵菌（Beauveria bassiana）、黑孢霉（Nigrospora oryzae）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、Ophiosphaerella agrostidis和竹黃菌（Shiraia bambusicola）。在20 ℃儲藏時，43% RH下儲藏的稻谷主要菌種是N.oryzae、O.agrostidis、錯綜赤霉（Gibberella intricans）和A.flavus；75%和85% RH下的稻谷中主要菌種是B.bassiana和A.flavus。在25 ℃儲藏時，稻谷中主要菌種是B.bassiana、A.flavus、黑曲霉（Aspergillus nigers）和O.agrostidis。在30 ℃儲藏時，43% RH下儲藏的稻谷主要菌種是赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、A.flavus和熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）；75% RH下的稻谷中主要菌種是A.flavus、G.intricans、O.agrostidis和B.bassiana；85% RH下的主要菌種是A.flavus、鏈格孢霉（Alternaria longissima）、O.agrostidis和B.bassiana。在40 ℃儲藏時，稻谷中主要菌種是N.oryzae、B.bassiana、A.flavus、A.longissima和O.agrostidis。綜上所述，A.flavus在各溫度、濕度條件下都占有較大比例，且當相對環境濕度達到85%時，在各菌種中占有最大比例，這與柳顯文[23]研究中A.flavus生長最適RH為80%～90%的結果一致。A.flavus產生的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是稻谷中主要污染真菌毒素[24-25]，所以控制稻谷儲藏條件減少A.flavus的產生，才能從源頭上減少稻谷中AFB1的污染。另外A.ochraceus在30 ℃、43% RH條件下豐度明顯升高，這與劉彬[26]研究的赭曲霉菌的最佳生長溫度20 ℃和濕度18%～22%的結果有所不同，推測可能的原因是低濕度條件抑制了A.flavus的生長[27]，從而導致了A.ochraceus豐度的上升。A.ochraceus產生的赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）也是谷物中重要的污染真菌毒素[28-29]，OTA已被確定具有腎毒性、免疫毒性、致癌性和致畸性[30]，因此在儲藏過程中也應避開這一儲藏條件。

2.4 不同儲藏條件下稻谷中真菌群落差異分析

在97%的相似度下，得到每個稻谷樣品的OTU數，利用Venn圖可以展示處于不同儲藏狀態下的稻谷樣品中共有和各自特有的OTU數目，直觀展示稻谷樣品間OTU的重疊情況。Venn圖中不同顏色圖形代表不同儲藏條件，不同顏色之間交疊部分數字為不同儲藏條件下的稻谷共有的OTU數。

由圖3可知，原始稻谷樣品和不同溫度、濕度條件儲藏后的稻谷樣品中真菌群落之間存在特性和共性。原始稻谷樣品與10 ℃儲藏條件下的稻谷相比，有41種特性OTU，與20 ℃相比，有46種特性OTU，與25 ℃相比，有75種特性OTU，與30 ℃相比，有76種特性OTU，與40 ℃相比，有44種特性OTU。可以看出25 ℃和30 ℃條件下的真菌群落差異性相較原始稻谷樣品更大。說明這兩個溫度對稻谷儲藏過程中真菌群落的改變影響最大。相同溫度下，不同環境RH儲藏的稻谷真菌之間也存在特性和共性。在同一溫度下時，43% RH下儲藏的稻谷真菌特性OTU相對最多，且隨著環境RH的升高，與原始稻谷共有的OTU數量減少。這說明相同溫度條件下，濕度越高儲藏稻谷中真菌群落的變化就越大。相同環境RH下，不同溫度儲藏的稻谷真菌群落之間也存在特性和共性。43% RH下，稻谷真菌共性OTU有88種，10、20 ℃和40 ℃時特性OTU較25 ℃和30 ℃多，說明43% RH時，10、20 ℃和40 ℃條件下的真菌群落多樣性比25 ℃和30 ℃條件下高；75% RH和85% RH下，稻谷真菌共性OTU分別有47種和42種，且在40 ℃時特性OTU數遠多于其他幾個溫度，說明40 ℃ 75% RH和85% RH的條件下稻谷真菌群落多樣性相對較高。盡管通過高通量測序得到很多的真菌種類，但是也只有少數真菌會在儲藏過程中生長發育，并在一些特定的外部條件作用下才會產生不良的影響[31]。

圖3 原始稻谷及不同條件儲藏后稻谷中真菌的OTU分布比較Venn圖Fig.3 Venn diagram of OTU distribution of fungi in fresh rice and rice stored under different conditions

對稻谷中真菌群落進行PCA，圖中不同條件儲藏的稻谷中真菌群落距離越近，則表示群落相似度越高。由圖4可知，原始稻谷樣品與10 ℃、43% RH儲藏條件下的稻谷樣品位置相對較近，說明這兩種儲藏狀態下的稻谷樣品中真菌群落物種多樣性差異較小；原始稻谷樣品與剩余其他儲藏條件下的稻谷樣品位置間均相對分散，說明稻谷樣品之間真菌群落物種多樣性差異較大。在相同儲藏溫度下，10、20、25、40 ℃時，3種不同環境RH中的稻谷樣品位置相對分散，說明這些儲藏條件下的稻谷樣品的真菌群落差異性較大，而30 ℃時，75% RH和85% RH中的稻谷樣品位置幾乎重疊，說明此儲藏條件下的稻谷真菌群落多樣性差異較小。在相同環境RH下，可以發現在43% RH時，原始稻谷樣品與不同儲藏溫度下的稻谷樣品位置相對分散，說明稻谷真菌群落物種多樣性差異較大；75%、85% RH下，20、25 ℃和30 ℃的稻谷樣品位置相對集中，說明這6種儲藏條件下的稻谷真菌群落物種多樣性差異較小。

圖4 原始稻谷及不同條件儲藏后稻谷中真菌的PCA圖Fig.4 PCA plots of fungal communities in fresh rice and rice stored under different conditions

3 結 論

采用Illumina HiSeq高通量測序技術對原始稻谷與在不同溫度、濕度條件下儲藏后的稻谷中的真菌多樣性和菌群結構進行分析，對OTU進行物種分類后發現，原始稻谷及在不同溫度、濕度條件儲藏后的稻谷中的真菌群落共計屬于6 個門、24 個綱、67 個目、160 個科、285 個屬、406 個種。與原始稻谷樣品相比，不同溫、濕度條件儲藏后的稻谷真菌群落組成與豐度均發生了變化。其中優勢菌種為B.bassiana、A.flavus和N.oryzae，且隨著濕度的升高，A.flavus占比越來越高。因此認為，溫度和RH會影響儲藏稻谷中的微生物群落，所以濕度和溫度控制是水稻貯藏的重要制約因素。較高的RH更有利于某些真菌的發育，并進一步加速了水稻品質劣變。其中A.flavus受濕度影響較大，在85% RH時，相對豐度在各儲藏溫度下都達到最大，可以認為是影響稻谷品質的關鍵菌屬，A.flavus產生的AFB1會對人體造成極大危害，所以對A.flavus的防控同時可以從源頭上降低AFB1發生的可能性。通過Venn分析與PCA，可以發現原始稻谷樣品與在不同溫度、濕度條件下儲藏后的稻谷樣品真菌群落中，既具有共有真菌菌種，也具有特有真菌菌種，原始稻谷樣品與不同條件儲藏后的樣品中真菌群落多樣性存在較大差異，不同溫、濕度條件中的稻谷樣品真菌群落多樣性之間也存在差異，但20、25、30 ℃下75%和85% RH儲藏條件下的稻谷真菌群落多樣性之間差異較小。