紅曲霉對白霉干酪理化及流變特性的影響

焦晶凱，劉振民，鄭遠榮，劉 景

（乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，上海 200436）

紅曲霉（Monascus）的應用在近年來備受關注，紅曲霉發酵最為常見的產物即為紅曲米，紅曲米的應用已經存在了上千年的歷史，通常是由紅曲霉（紫色紅曲霉M.purpureus、叢毛紅曲霉M.pilosus、佛羅里達紅曲霉M.floridanus、紅色紅曲霉M.ruber）發酵而成的。此外，紅曲霉也被應用在釀酒、制藥和食品保護劑等方面。紅曲霉可以產生一系列的生物活性物質，并對人體產生有益健康的作用，如洛伐他?。{克林）[1-2]、紅曲酸[3]、異黃酮[4]、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）[5]以及紅曲色素[6]。Zhao Yongxia等[7]分離來自紅曲霉的麥角固醇，并證實來自紅曲的麥角甾醇具有很強的抗脂質過氧化和抗氧化能力，以及保護和修復受損細胞的能力。Su Nanwei等[8]發現紅曲霉發酵的紅曲米提取物對Hep G2癌細胞具有選擇性的細胞毒性作用，誘導癌細胞凋亡，而對正常的細胞無害。Wang Pan等[9]研究發現紫色紅曲霉發酵產物可以改善凡納濱對蝦的生長性能、免疫反應、腸道形態、微生物群和抗病性。Wang Nifei等[10]從紅曲霉發酵液中提取出對RAW 264.7巨噬細胞具有免疫調節作用的胞外多糖。Choe等[11]研究表明紅曲霉色素的蘇氨酸衍生物可以減少小鼠體質量、附睪脂肪質量和腹部脂肪大小。

白霉干酪屬于表面霉菌成熟軟質干酪，它的特點是由于卡門柏青霉（Penicillium camemberti）等青霉菌生長在表面而使表面形成菌絲體，類似包裹一層白色外衣，并賦予干酪特殊的芳香風味。最為典型的白霉干酪即為卡門貝爾干酪，卡門貝爾干酪源自于法國的諾曼底地區，它起源于法國，流傳到歐洲國家，再到南美、新西蘭和澳大利亞[12]。由于霉菌的引入帶來了更強的蛋白水解和脂肪水解作用，從而產生了更多脂肪酸、醛類、酯類和萜烯化合物，使白霉干酪的風味更加的豐富。有學者對表面霉菌干酪的附屬發酵劑進行了深一步研究，如通常會加入漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）和馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）改善奶酪的質地[13]；白地霉（Geotrichum candidum）也通常被用來提高卡門貝爾干酪的風味[14]，并成為常規的生產模式商業菌株。

本研究以傳統可食用性菌株紅曲霉為研究對象，并作為附屬發酵劑參與表面成熟白霉干酪的成熟過程，通過測定其基本理化指標、功能性及有害性成分、質構和流變特性等分析紅曲霉在軟質成熟干酪中的應用價值，并分析紅曲霉對這類干酪成熟過程的影響。以期為紅曲霉的應用拓展新的方向，同時紅曲霉的加入旨在改變表面成熟軟質干酪的風味、外觀和質地，擴展軟質奶酪的新品類。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PD206746.0FR菌種（主要為卡門柏青霉）、凝乳酶Marzyme 150MG 美國Danisco公司；CHN-22菌種（主要為乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）、乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌雙乙酰亞種（L.lactisssp.diacetylactis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）） 科漢森（中國）有限公司；實驗室自篩選菌種紅曲霉M.CJ781。

奶酪槽 英國Armfiled公司；Inlab solids pro三合一pH計探頭 瑞士METTLER公司；SPECORD紫外分光光度計、ColorFlex EZ色差儀 美國HunterLab公司；TA-Hdi型質構分析儀 英國Stable Micro Systems公司；mb45水分測定儀 美國OHAUS公司；ARES-G2流變儀美國TA儀器公司；Ultimate 3000高效液相色譜 美國賽默飛儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 白霉干酪的制備

首先將生牛乳（由光明乳業股份有限公司牧場提供，蛋白2.9%，脂肪3.1%）進行巴氏殺菌，殺菌乳冷卻至34～36 ℃后泵送進入奶酪槽，加入主發酵劑CHN-22菌種和附屬發酵劑PD206746.0FR菌種，菌種接種量分別為5 U/100 L和0.4 U/100 U，當發酵pH值達到6.4～6.5時加入凝乳酶Marzyme 150MG，使用量為4 000 IMCU/100 L，凝乳30 min后進行切割，切割后間隔緩慢攪拌45～60 min，隨后泵入模具，25 ℃條件下過夜，飽和食鹽水鹽漬1 h。所得干酪置于28 ℃環境下成熟2～3 d，后置于4 ℃環境下成熟25 d。得白霉干酪成熟初始階段C1干酪樣品（發酵第1天）、中期階段C2干酪樣品（發酵第15天）和末期階段C3干酪樣品（發酵第28天）。

1.2.2 紅曲霉-白霉干酪的制備

通過從紅曲米、腐乳等傳統食品中分離篩選出優勢紅曲霉M.CJ233，該株菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC No.18563。紅曲霉M.CJ2330種子液制備：挑取紅曲霉菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）培養基中活化，PDA培養基包括馬鈴薯粉4～6 g/L、葡萄糖18～22 g/L，培養基的pH值為5.4～5.8，隨后進行10～20 倍的擴培。紅曲霉-白霉干酪的制備方法與1.2.1節白霉干酪的制備基本相同，僅將附屬發酵劑PD206746.0FR菌種變為同時加入發酵劑PD206746.0FR菌種和紅曲霉M.CJ233種子液。得紅曲霉-白霉干酪成熟初始階段MCC1干酪樣品（發酵第1天）、中期階段MCC2干酪樣品（發酵第15天）和末期階段MCC3干酪樣品（發酵第28天）。

1.2.3 干酪的理化測定

pH值測定采用用Inlab solids pro三合一pH計插入干酪樣品直接測定。采用mb45水分測定儀測定干酪樣品水分含量。蛋白質測定采用AOAC 2001.14[15]；脂肪測定采用AOAC 933.05[16]；總膳食纖維測定采用AOAC 991.43[17]；灰分測定采用AOAC 935.42[18]。色差采用ColorFlex EZ色差儀進行測定；紅色素、橙色素和黃色素分別以干酪乙醇提取液在500、470 nm和400 nm波長下的吸光度表示。

1.2.4 感官評價分析

按照Zhao Zheng等[19]的測試方法，根據9 個尺度進行分析，即1-極度不喜歡，9-極度喜歡。向平常有品嘗或接觸干酪的14 人（8 位男性和10 位女性）分發問卷，以評估總體接受度。

1.2.5 質構特性

干酪的質構分析采用質構儀測定，測量方式為兩次下壓，模式measure force in compress；測試前速度1.00 mm/s，測試速度1.00 mm/s，測量后探頭回程速度5.00 mm/s；測試距離5 mm；探頭類型為P/0.5R，每組樣品平行測定5 次。

曲線參數及其定義：1）硬度：最大力值以N（g）表示，表示干酪對變形的抵抗能力。2）黏附性：食品表面和其他物體（舌、牙、口腔）附著時，剝離它們所需要的力。3）彈性：表示收到徹底擠壓后恢復形變的能力。

1.2.6 流變特性測定

采用ARES-G2流變儀，樣品在恒定溫度20 ℃下統一測定，04 RAD錐形鈦板，平板直徑50 mm，間隙1 mm，應變掃描范圍為0.01%～10%，動態頻率掃描在20 ℃下，根據線性黏彈區所確定的應變值0.1%，GAP設置為1 mm，在0.1～100 rad/s范圍內頻率掃描，測定儲能模量（G’）、損耗模量（G’’）、復合模量（G*）和耗損角tanδ的變化情況。

1.2.7 干酪的功能及有害成分測定

洛伐他汀和橘青霉素測定：使用5 mL 68%的乙醇提取1 g樣品，混合1 h，后置于40 ℃水域下保持12 h，2 000×g離心15 min，使用沃特曼1號濾紙過濾上清液并真空蒸干。取1 mL流動相溶解并用0.45 μm膜過濾后上機測試。使用Dionex Ultimate 3000超高性能液相色譜與四極Orbitrap質譜儀聯用，在電噴霧離子源模式下進行測定，使用C18柱（180 μm×20 mm，100 ?），用含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的甲醇梯度洗脫進行分析，甲醇從2%增加到98%，保持1.5 min，隨后在0.5 min內降到2%，并維持2 min達到平衡。

GABA測定：GABA的提?。菏褂?0 mL 75%乙醇溶液提取1 g樣品，混合30 min，6 500×g離心10 min。使用沃特曼1號濾紙過濾上清液并真空蒸干，取1 mL流動相溶解并用0.45 μm膜過濾后上機測試。液相色譜-質譜聯用方法同洛伐他汀和橘青霉素測定方法。

黃曲霉素測定：采用GB 5009.24—2010《食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定》方法。

1.3 數據處理與分析

硬度、黏性、彈性數據利用TA-Hdi型質構分析儀自帶軟件Exponent進行處理獲得。數據結果利用統計分析軟件SPSS進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的理化指標

如表1所示，紅曲霉-白霉干酪的紅度值a*為7.81～19.05，顯著高于白霉干酪，由圖1所示，可以明顯看到紅曲霉-白霉奶酪的紅色素沉淀，這是由于紅曲霉在生長過程中可以產生天然的紅曲色素，紅曲色素是一組通過酯化聚酮生色團和β-酮酸衍生而來的紅曲霉代謝產物，具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化的作用[20]，Lee等[21]發現紅曲色素monascin和ankaflavin可以降低低密度脂蛋白膽固醇并保留和促進高密度脂蛋白膽固醇的形成，由表1也可以看出，紅色素、橙色素和黃色素的值在不同發酵階段也是顯著高于白霉干酪；通過感官測試，干酪在發酵初期時比較受歡迎，這與我國本土的飲食文化相關，隨著成熟時間的延長，感官評定分數逐漸下降，而可以看出在成熟后，加入紅曲霉的干酪風味得到了更多人的接受。

表1 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的理化指標Table 1 Physiochemical parameters of white mold cheese with and without Monascus

圖1 紅曲霉-白霉干酪Fig.1 White mold cheese with Monascus at the middle and late ripening stages

結果顯示，額外添加紅曲霉，使奶酪的膳食纖維和蛋白質含量增高，如表1所示，紅曲霉-白霉干酪的蛋白質為17.4%～19.6%，膳食纖維為5.22%～6.81%，而白霉干酪的蛋白質為13.8%～16.9%，膳食纖維為3.22%～5.16%，Sun Congcong等[22]也發現紅曲霉可以增加豆渣的膳食纖維含量。但是，脂肪并未表現增加，已有學者對紅曲霉菌進行研究發現，該菌具有一定降解脂肪的作用，如張茜等[23]研究了20 株紅曲霉在含有膽固醇的培養基中生長情況，結果表明，供試的20 株紅曲霉均具有降解膽固醇的能力，部分菌株對膽固醇降解率甚至超過50%。Suraiya等[24]研究發現紅曲霉提取物可以抑制3T3L-1細胞的成脂分化，經過油紅O染色顯示細胞胞質油滴呈紅曲霉提取物劑量依賴性下降，與對照相比，紅曲霉提取物處理的細胞中脂質的積累較低。紅曲霉菌產生的洛伐他汀也是公認降脂的主要成分[25]。

2.2 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的理化指標的質構特性

由表2可以看出，紅曲霉-白霉干酪在成熟初期和中期，硬度顯著高于白霉干酪，而到了成熟期末時，其硬度與白霉干酪硬度無顯著差異，白霉干酪的硬度為1 341.52 g，紅曲霉-白霉干酪的硬度為1 376.83 g。霉菌生長到一定階段時會產生蛋白酶，使干酪中的蛋白膠束發生水解，蛋白空間網絡結構強度和剛度降低[26]，因此可以解釋紅曲霉-白霉的硬度在末期逐漸變小，而白霉干酪硬度之所以沒有減少，可能原因為白霉干酪的水分損失帶來的硬度增加，大于白霉蛋白酶水解帶來的硬度減小。紅曲霉-白霉干酪的彈性為90.35～92.15，黏性為1 078.47～1 766.82，顯著高于白霉干酪，這可能與增加的紅曲霉-白霉干酪膳食纖維有關，膳食纖維與持水力非常相關，不僅可溶性膳食纖維和不可溶膳食纖維的比例影響持水力[22]，可溶性膳食纖維顆粒的比表面積增加也會增加持水的能力[27]。加入紅曲霉后帶來的質構的變化，可能也增加了干酪的可接受程度（如表1感官評定所示）。

表2 不同成熟期軟質干酪的質構特性Table 2 Textural properties of soft cheese at different ripening stages

2.3 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的流變特性

如圖2所示，G’和G’’隨著角頻率的增加而緩慢增加，并且G’顯著大于G’’說明干酪樣品表現出良好的固態彈性，最初成熟階段，兩種奶酪的G’并沒有顯著差別，隨著成熟時間的延長，紅曲霉-白霉干酪的G’明顯增加，說明額外添加紅曲霉之后可以很好地增加干酪的彈性。此外，G’隨著干酪成熟時期的延長不斷增加，說明隨著干酪的成熟，質地趨勢漸好。

圖2 干酪成熟過程中的流變特性Fig.2 Rheological properties of cheese at different ripening stages

機械損耗角正切（tanδ）是G’’與G’之比，tanδ值越小，說明復配凝膠體系的彈性越大，tanδ值越大則說明復配凝膠體系的黏性越大[28]。紅曲霉-白霉成熟末期樣品（MCC3）隨著角頻率的增加，tanδ值的降低斜率最大，說明，此時的MCC3樣品的彈性最為良好。

2.4 白霉干酪和紅曲霉-白霉干酪的功能及有害成分分析

紅曲霉被廣泛應用于20多種食品中，而沒有對健康產生不利的影響，此外，以紅曲霉發酵生產的紅曲米被廣泛的用于食品、防腐劑、食品著色劑和制藥，公認的紅曲霉代謝產物具有抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖和降壓等功效[29]。

檢測紅曲霉-白霉干酪中具有降血脂功效的洛伐他汀和可以緩解疲勞的GABA含量，如圖3所示，在紅曲霉-白霉干酪中期和末期分別檢測到（0.05±0.01）mg/kg和（2.21±0.01）mg/kg洛伐他汀，未加入紅曲霉的白霉干酪的并未檢測到，眾所周知，洛伐他汀是降血脂藥物中的主要成分，各種臨床實驗表明，紅曲霉代謝產物紅曲米在不耐受常規的他汀類藥物的高血脂患者中極為有效，紅曲霉干酪是另一種極為有潛力替代紅曲米的治療高血脂患者的食物。

圖3 干酪中的橘青霉素、黃曲霉毒素、洛伐他汀和GABA含量Fig.3 Contents of citrinin, aflatoxin, mevinolin and gammaaminobutyric acid in cheese

在所有干酪中均檢測到GABA，白霉干酪中的GABA含量為（0.63±0.01）～（1.25±0.07）mg/kg，紅曲霉-白霉干酪中的GABA含量為（0.54±0.02）～（0.70±0.01）mg/kg。GABA是交感神經系統中的抑制性神經遞質，在一項關于果糖誘導的高血壓研究中發現，胃內給服含有GABA（1 mg/（kg·d））的紅曲霉發酵產物后，可使血壓升高恢復到正常水平，而等計量的純GABA給藥并沒有產生作用[29]。紅曲白霉干酪中的GABA的作用有待于進一步深入研究。

雖然紅曲霉早已廣泛應用于人們的生活中，但它所產生的橘青霉素是目前科學家們主要擔心會對人體產生危害的物質，橘青霉素是一種真菌毒素，對人體肝臟和腎臟有害。目前國際上關于橘青霉素的限量法規如，日本允許限量為200 μg/kg；2019年歐盟委員會發布2019/1901號條例，修訂以紅曲霉發酵的大米基食品補充劑中橘青霉素的最高限量從2 000 μg/kg降低到100 μg/kg。通過檢測發現，紅曲霉發酵的干酪中未檢測到黃曲霉素，但存在少量橘青霉素，其含量在100 μg/kg之下，此外除發酵初期橘青霉素含量接近100 μg/kg（可能由發酵劑帶入）外，其他樣品含量均低于50 μg/kg，遠低于商業用途的紅曲米中橘青霉素的含量，有學者研究紅曲米中橘青霉素在0.28～2 458.80 mg/kg范圍不等[30]。橘青霉素的存在給紅曲霉相關產品的應用帶來了極大限制，目前有很多學者通過科學手段降低橘青霉素的含量，有學者使用三羥基異黃酮[31]、黃酮類化合物[32]、蘆丁[33]等化合物誘導抑制，降低了紅曲霉產生橘青霉素含量；再有通過改變生長環境如降低pH值、增加極低頻磁場等方式抑制橘青霉素的產生；也有學者通過敲除橘青霉素合成相關基因[34]等手段降低橘青霉素的含量。通過這些方式可以幫助更好地提高和控制紅曲霉相關產品安全和質量。

3 結 論

本研究分析了紅曲霉在牛乳中的發酵特性，并與成熟軟質霉菌干酪-白霉干酪進行對比，表征了紅曲霉-白霉干酪特性。紅曲霉-白霉干酪對比傳統白霉干酪，具有天然紅曲色素的外觀，含有更多的蛋白質和膳食纖維，并在更高含水量的情況下，維持脂肪含量不變。質構和流變特性也加以改善，同時增加了洛伐他汀功能性成分。額外添加紅曲霉也增加了干酪的可接受度。結果分析表明，紅曲霉可以很好地應用于干酪的生產，并賦予干酪更好的質構特性、更多的活性成分和營養價值，為紅曲霉的應用開辟了更廣闊的前景，增加了軟質成熟干酪附屬發酵劑的新品類，為進一步研究適合中國人口味的軟質成熟干酪奠定基礎。