高通量測序分析混合菌群中的嘔吐毒素降解菌

高 慧，牛家峰，楊 華，陸兆新，陳美容，呂鳳霞

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

嘔吐毒素，也稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是產毒鐮刀菌等產生的次級代謝產物[1-3]，在谷物及其制品中均有較高的污染率。DON作為一種毒力因子，不僅會加速鐮刀菌對谷物的侵染，而且霉變谷物中積累的DON進入食物鏈后對人、畜都具有潛在危害[4-7]，如引起食欲不振、免疫抑制、惡心、嘔吐等。然而各種物理[8-9]和化學方法[10-11]對DON的去除效果并不理想的同時還會對谷物的營養價值造成損失，故生物脫毒法因其綠色安全和高效[12-13]成為當前研究的熱點。DON的生物脫毒主要分為兩類，一類是利用微生物發酵產生的菌體細胞對DON的吸附作用從而去除谷物及其制品中的DON[14]，另一類是利用微生物代謝產生的酶對DON進行降解。DON分子中的C12,13位的環氧基團是最主要的致毒基團，微生物能夠將其脫環氧化生成產物DOM-1[15-17]，毒理學研究表明，DOM-1的毒性極低，基本接近無毒[18]。此外，C3位上的羥基也是DON的主要致毒基團之一，目前研究人員也已從土壤等環境樣品中篩選出多種微生物能將DON氧化[19-21]與異構化[22-24]，形成產物3-keto-DON和3-epi-DON，研究表明它們的毒性均比DON低[25]。

雖然降解DON的微生物廣泛存在于各種自然環境，但是純培養物卻很難獲得。目前DON降解菌株的篩選主要利用實驗室條件下的富集培養，在此類方法下，培養基的選擇尤為重要。目前采用的篩選培養基主要分為兩類，一類是利用營養貧乏的無機鹽培養基添加DON為碳源，篩選獲得能夠利用DON為唯一碳源的菌株；另一類則是利用添加有營養物質的培養基進行富集培養，同時檢測培養基中的DON降解情況，如He Jianwei等[26]采用CMB培養基分離得到德沃斯氏菌17-2-E-8。當利用無機鹽培養基進行篩選時，因營養匱乏可能會導致某些DON降解菌不能生長，而采用營養豐富的培養基，混合菌群中不具有DON降解能力的優勢微生物又會抑制DON降解菌的生長，這些都導致了DON降解菌篩選的困難。部分研究人員選擇結合原位富集對自然環境中的DON降解菌進行富集，再于實驗室條件下篩選，如Zhai Yaoyao等[27]在土壤中長時間定期添加DON增加土壤中的DON降解菌的種類及豐度，然后再于實驗室條件下富集培養，獲得混合菌群LZ-N1。此外，高通量測序方法也被用于DON降解菌株的篩選，如He Weijie等[28]采用原位富集法獲得DON降解混合菌群PGC-3后，并結合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳和高通量測序分析不同DON濃度或添加不同抗生素條件下的微生物多樣性變化，推測混合菌群中的主要DON降解菌種。但基于高通量篩選方法分析混合菌群中不同稀釋倍數間的DON降解效果差異和菌種差異的研究鮮見報道。

本研究首先用以DON為唯一碳源的無機鹽培養基對土壤進行3 輪篩選，降低土壤中不具有DON降解能力的微生物的種類。然后在無機鹽培養基中外加氮源對DON降解菌進行富集培養，篩選到一種能夠完全降解DON的混合菌群LG-6-7，并且利用高通量測序方法對該混合菌群不同稀釋倍數間的微生物多樣性進行分析，從而推測混合菌群中的主要DON降解菌。最后，對該混合菌群進行分離純化，并對降解菌的降解特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

采集自全國不同地區的土壤樣品見表1，采自距離地表10～15 cm處的土壤，采集時間2019年2—4月。

表1 實驗采集土壤樣品來源Table 1 Sources of soil samples collected in this study

1.1.2 培養基

MM（無機鹽）培養基：Na2HPO4·12H2O 1.6 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaNO30.5 g/L、(NH4)2SO40.05 g/L、CaCl20.025 g/L；MMT培養基：MM＋蛋白胨2 g/L；MMY培養基：MM＋酵母提取物2 g/L；MMG：MM＋葡萄糖2 g/L；MM＋sucrose：MM＋蔗糖2 g/L；LB培養基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L；100 d LB培養基：100 倍稀釋的LB培養基；NB培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L；100 d NB培養基：100 倍稀釋的NB培養基。

1.1.3 試劑

DON標準品 加拿大TripleBond公司；甲醇、無水乙醇（均為色譜級） 國藥集團化學試劑有限公司；液氮、鹽酸、吡咯喹啉醌、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 南京輝亞生物科技公司。

1.2 儀器與設備

Ultrimate 3000高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC） 上海賽默飛世爾科技有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；HYL-A型全溫搖瓶柜 太倉市強樂實驗儀器有限公司；Centrifuge 5804R型高速離心機 德國Eppendorf公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；BCD-539WT海爾醫用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；LS-50HD型立式壓力蒸汽滅菌器美國Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 土壤微生物的富集培養

取5 g土壤用20 mL無菌水懸浮，置于180 r/min、37 ℃條件下混勻4 h，取土壤懸浮液200 μL接種于MM培養基（含20 μg/mL DON）中，37 ℃、180 r/min條件下富集培養7 d，以滅菌后的土壤懸浮液作為對照排除土壤對DON的吸附作用，HPLC檢測土壤樣品的DON降解效果，將土壤在以DON為唯一碳源的MM培養基中傳代培養3 次，獲得具有DON降解活性的土壤樣品。

取具有DON降解活性的土壤樣品200 μL，接種到添加不同碳氮源的無機鹽培養基中連續傳代培養，獲得能在連續傳代中保持穩定降解活性的土壤微生物群落。

1.3.2 混合菌群不同稀釋倍數的降解能力

將混合菌群LG-6梯度稀釋至10－1～10－10后，接種以及涂布到MMT液體和固體培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養72 h，HPLC檢測不同稀釋倍數混合菌群降解DON的效果，同時從具有DON降解活性的稀釋梯度對應的涂布平板上挑選單菌落，接種于MMT液體培養基中培養并檢測其DON降解效果。

1.3.3 混合菌群微生物多樣性分析

將混合菌群LG-6梯度稀釋至10－7和10－8后接種于新鮮的MMT液體培養基中，37 ℃、180 r/min培養48 h后，8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，采用液氮速凍后保存于－80 ℃超低溫冰箱中，送往上海美吉生物公司進行高通量測序，對混合菌群中的微生物組成進行分析。

1.3.4 DON降解菌的分離純化

將混合菌群LG-6-7稀釋涂布平板上不同形態的單菌落挑選出來，接種于MMT液體培養基中，置于37 ℃、180 r/min條件下培養48 h。提取細菌基因組DNA，使用細菌16S rDNA通用引物進行基因擴增，通用引物為上游引物27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、下游引物1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。擴增產物由上海生工生物技術有限公司進行測序。

利用BLAST搜索法鑒定與分離菌株16S rDNA基因相似度（＞97%）的序列，根據微生物多樣性分析結果，將分離出的不同單菌落于MMT液體培養基（DON質量濃度50 μg/mL）中進行混合培養，獲得能夠對DON進行降解的純培養物，并使用MEGA軟件構建DON降解菌的系統發育樹。

1.3.5 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243對DON的降解

將假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接種量接種于以下條件：培養溫度16、20、25、30、37、42 ℃，培養基pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培養基MM、MMT、MMY、MM＋sucrose、NB、100 d NB、LB、100 d LB。當其中一個因素發生變化時，其他因素固定在37 ℃、pH 7.0、MMT培養基。180 r/min培養72 h后，HPLC檢測培養基中的DON降解情況。

1.3.6 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243的微生物生長及其與DON的降解關系

將假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接種量接種至MMT中，DON質量濃度為50 μg/mL，培養48 h后按2%接種量接種至MMT培養基中，置于37 ℃、180 r/min條件下培養，每隔12 h取樣測定其OD600nm以及DON質量濃度，繪制微生物生長與DON降解效果之間的曲線。

1.3.7 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243的發酵上清液、細胞破碎液以及細胞碎片對DON的降解效果

將假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接種量接種于MMT液體培養基中，37 ℃、180 r/min條件下培養48 h，發酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液過2 次0.22 μm無菌濾膜得到發酵上清液。細胞沉淀重懸于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中采用超聲破碎（400 W，工作5 s，間歇5 s），破碎液在4 ℃、8 000 r/min離心30 min，上清液即為細胞破碎液（過2 次0.22 μm無菌濾膜），沉淀即為細胞碎片。將未處理的發酵上清液、細胞破碎液、細胞碎片以及煮沸10 min處理的上清液、細胞破碎液、細胞碎片分別與DON在37 ℃條件下反應不同時間，加入酸化甲醇中止反應，HPLC檢測反應不同時間下反應體系中的DON降解效果。

1.3.8 DON降解率的測定

1.3.8.1 DON標準曲線的建立

HPLC條件：反相C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-水（30∶70，V/V），流速為0.6 mL/min，檢測波長218 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃。

用去離子水配制0、12.5、25、50、75、100 μg/mL的DON標準品溶液，HPLC檢測，建立DON的峰面積與質量濃度之間的一元線性回歸方程。DON標準曲線方程為y=0.280 2x－0.161 7，相關系數為0.999 1，表明DON質量濃度在0～100 μg/mL范圍內，與對應的峰面積之間具有良好的線性關系。

1.3.8.2 DON降解率的計算

DON降解率按下式計算：

式中：C0為對照組DON質量濃度/（μg/mL）；C為實驗組DON質量濃度/（μg/mL）。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 土壤的富集培養

土壤樣品經過MM培養基的3 輪富集篩選，發現來自山西省太原市種植黃豆的土壤樣品可以在7 d內完全降解MM培養基中的DON，而滅菌后的土壤懸浮液不具備降解DON的效果，故排除土壤對DON的吸附作用。

隨后，將此活性土壤樣品轉接入含有不同碳氮源的無機鹽培養基中。如圖1所示，土壤樣品在添加蛋白胨、酵母提取物和蔗糖的MM培養基中降解率均為100%，在MM培養基中的DON降解率為94%。而在添加葡萄糖的無機鹽培養基中，土壤樣品不能降解DON。經過在培養基中連續傳代培養，獲得混合菌群LG-6能夠穩定高效降解MMT培養基中的DON，HPLC檢測圖譜如圖2所示。保留時間為10 min左右的吸收峰為DON的吸收峰，當培養72 h后，DON峰完全消失，表示DON被完全降解。

圖1 土壤樣品在不同培養基中培養7 d的DON降解效果Fig.1 Degradation efficiency of DON in soil samples cultured in different media for 7 days

圖2 混合菌群LG-6培養時的HPLC圖Fig.2 HPLC profiles of culture medium with bacterial consortium LG-6 before and after culture for 72 h

采用合適的富集培養基可以為DON降解菌提供有利的生長條件，降低DON降解菌篩選與分離的困難。由圖1可見，混合菌群LG-6在不同培養基中培養時，其降解DON的效果有所差異，添加葡萄糖時，可能因葡萄糖不利于混合菌群中DON降解菌的生長或葡萄糖對DON的降解產生抑制而使混合菌群LG-6的DON降解活性丟失[29-31]，而在添加特定碳氮源的MM培養基中其DON降解率達到100%。經過連續傳代培養，混合菌群LG-6在MMT培養基中降解DON的能力最穩定，所以選擇MMT培養基作為其富集培養基。

2.2 混合菌群不同稀釋倍數的DON降解能力

經過對混合菌群進行梯度稀釋，發現不同稀釋倍數混合菌群之間的DON降解效果具有明顯差異，結果如圖3所示。當混合菌群稀釋至10－7時，混合菌群傳代培養仍然保持DON降解率為100%，而當其稀釋至10－8時傳代培養，其DON降解活性完全丟失。因為從混合菌群LG-6稀釋至10－7后的涂布平板上并未挑選到具有降解DON能力的單菌落，所以猜測混合菌群LG-6對DON的降解不是單一菌種的作用，而是多種微生物之間的共同作用。稀釋至10－7的混合菌群LG-6-7和稀釋至10－8的混合菌群LG-6-8之間DON降解效果的差異可能是因為在梯度稀釋過程中DON降解菌發生丟失，故其中丟失的菌種或與混合菌群降解DON的能力有關。

圖3 稀釋倍數對混合菌群LG-6降解DON的影響Fig.3 Effects of dilution ratio on DON degradation by bacterial consortium LG-6

2.3 混合菌群LG-6-7和混合菌群LG-6-8的微生物多樣性分析

將這2 個不同稀釋倍數的混合菌群傳代培養后進行微生物多樣性檢測，采用美吉生物云平臺對稀釋至10－7的混合菌群LG-6-7和稀釋至10－8的混合菌群LG-6-8的微生物組成進行分析，結果如圖4所示。當稀釋至10－7時，其微生物組成為德沃斯氏菌屬（Devosia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、代爾夫特菌屬（Delftia）、節細菌屬（Arthrobacter）和假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）；稀釋至10－8時，其微生物組成為節細菌屬（Arthrobacter）和假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）。由此可見，2 個不同稀釋倍數間的差異菌種即為假單胞菌屬、德沃斯氏菌屬和代爾夫特菌屬，即混合菌群LG-6-7中起到DON降解主要作用的菌種可能為假單胞菌屬、德沃斯氏菌屬和代爾夫特菌屬，但是因為是多菌種共同對DON進行降解，導致無法分離到具有DON降解能力的單一菌落。

圖4 混合菌群LG-6兩個不同稀釋倍數間的菌群種類差異Fig.4 Difference in species composition between two dilution ratios of bacterial consortium LG-6

2.4 混合菌群LG-6-7中DON降解菌的分離純化

從混合菌群LG-6-7稀釋涂布平板上分離純化出全部不同形態的單菌落，對其16S rDNA序列進行擴增測序。通過序列比對，發現從平板上分離純化出的單菌落包括以下5種：A6-243與Devosiasp.strain M6-77的相似性為98.28%、B6-24與Pseudomonas resinovoransstrain S7的相似性為98.01%、C6-1與Delftia tsuruhatensisstrain D9的相似性為97%、D6-2與Arthrobactersp.MR-17的相似性為98.21%、E6-3與Pseudochrobactrumsp.strain OD42的相似性為95.97%。即混合菌群LG-6-7分離純化出的菌落與微生物多樣性測序結果一致，包括德沃斯氏菌屬、假單胞菌屬、代爾夫特菌屬（Delftia）、節細菌屬和假蒼白桿菌屬。

根據微生物多樣性分析推測結果，將德沃斯氏菌A6-243、假單胞菌B6-24和代爾夫特菌C6-1混合培養發現其能夠完全降解培養基種的DON。同時，將這3種菌兩兩混合，發現德沃斯氏菌A6-243和假單胞菌B6-24混合培養能夠完全降解培養基中的DON，而單獨培養時沒有降解DON的能力。因此混合菌群LG-6-7中的DON降解菌為假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243，其系統發育樹如圖5所示。值得注意的是，有研究表明德沃斯氏菌屬中一部分菌種不具有單獨降解DON的能力，而一小部分德沃斯氏菌屬可以單獨降解DON，例如，從土壤中篩選到的德沃斯氏菌17-2-E-8、德沃斯氏菌D6-9等[24,26]。假單胞菌屬也曾在DON降解菌中篩選到，如從混合菌群LZ-N1中分離得到的假單胞菌Y1與溶桿菌S1混合培養具有降解DON的能力[27]。

圖5 假單胞菌屬B6-24與德沃斯氏菌屬A6-243系統發育樹Fig.5 Phylogenetic trees of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

2.5 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解特性

為了研究假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解特性，測定不同溫度、pH值和培養基條件下的DON降解效果，結果如圖6所示。在16～37 ℃范圍內，混合菌群在72 h內能夠完全降解培養基中的DON，而在42 ℃條件下，DON降解率僅為21%。在pH 5.0～10.0的較寬范圍內，混合菌群均可以降解DON，在pH 7.0～8.0時，降解效果保持在100%。而在較酸和較堿條件下培養時，DON降解率在84%～98%之間。混合培養物在100 d NB、100 d LB、MMT、MMY、MM＋sucrose培養基中的DON降解率為100%，而在LB、NB和MM培養基中DON降解效果有所下降，降解率只有70%～98%。

圖6 培養條件對假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群降解DON效果的影響Fig.6 Effects of culture conditions on DON degradation by mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

由結果可知，較高溫度和較酸較堿的pH值對假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解效果均有影響。同時此混合菌群在以DON為唯一碳源的無機鹽培養基和含有碳氮源的培養基中都能生長并降解DON，但是在添加碳氮源的培養基中DON降解率更高，說明添加合適的碳氮源更加有利于混合菌群對DON的降解。

2.6 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的微生物生長與對DON降解

如圖7所示，此混合培養物在48 h內能夠完全降解培養基中的DON，混合菌群LG-6-7生長對數期主要為0～24 h，而DON的降解也主要發生在這一時期，由此可見，假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群對DON的降解隨著菌體量的增多開始。

圖7 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的生長曲線以及DON質量濃度變化Fig.7 DON degradation and growth profiles of mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

2.7 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群發酵上清液、細胞破碎液以及細胞碎片對DON的降解效果

為探究混合培養物是否為酶的作用以及降解酶在微生物體內存在的部位，研究未處理以及熱滅活處理的混合培養物發酵上清液、細胞破碎液以及細胞碎片對DON的降解作用，結果如圖8所示。未經處理的細胞破碎液以及細胞碎片可以在48 h內完全降解DON，而發酵上清液和熱滅活的處理組不能降解DON，說明細胞破碎液以及細胞碎片起到降解DON的作用。即假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群對DON的降解為酶的作用，且降解酶主要存在于胞內。

圖8 混合菌群發酵上清液、細胞破碎液以及細胞碎片與DON孵育不同時間DON質量濃度變化Fig.8 Changes in concentration of DON in supernatant, lysate and cell debris of mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243 incubated with DON for different periods of time

3 結 論

本研究通過實驗室條件下的富集培養，從土壤中篩選到能夠降解DON的混合菌群LG-6-7，并通過比較不同稀釋倍數間的微生物菌落組成的差異，推測出混合菌群LG-6中對DON起主要降解作用的可能為假單胞菌B6-24、德沃斯氏菌A6-243和代爾夫特菌C6-1。將混合菌群LG-6-7中的菌落進行分離純化，并根據微生物多樣性分析結果，將不同的單一菌株混合培養，發現假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合培養時可以在48 h內完全降解DON。同時，對假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的降解特性進行研究，確定該混合菌群培養溫度為37 ℃、pH 7.0，培養基為MMT培養基，培養48 h內完全降解培養基中的DON。并通過對該混合菌群發酵上清液、細胞破碎液及細胞碎片的DON降解效果進行研究，發現該混合菌群是通過微生物代謝產生的酶對DON進行降解，且DON的降解酶主要存在于胞內。本研究基于高通量測序分析混合菌群中不同稀釋倍數間菌種差異的方法及對混合菌群降解特性的研究，將為DON降解菌的篩選以及降解途徑的研究提供依據。