基于生物信息學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)對(duì)壇紫菜降血壓肽的篩選及活性分析

葉賢江，蘇志琛，林曉娟，陳繼承

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

全球每年估計(jì)有1 750萬(wàn) 人死于心血管疾病，約占全世界死亡人數(shù)的31%。高血壓是導(dǎo)致心血管疾病的重要原因，其并發(fā)癥包括但不限于冠心病、中風(fēng)、充血性心力衰竭、心律失常和腎功能衰竭[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）可通過破壞腎素血管緊張素系統(tǒng)和激肽系統(tǒng)的平衡而引起高血壓[2]。ACE抑制劑藥物如卡普托利、賴諾普利、依那普利在臨床治療中具有較強(qiáng)的降壓作用，但具有咳嗽、味覺障礙和皮疹等諸多副作用[3]。食源性降血壓肽由于其無(wú)毒、無(wú)副作用、安全性高，且對(duì)血壓正常者無(wú)降壓作用，適合長(zhǎng)期食用，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[4-5]。

壇紫菜是一類高蛋白、低脂肪、具有豐富多糖和礦物質(zhì)的多功能營(yíng)養(yǎng)食品，主要生長(zhǎng)在中國(guó)、日本和韓國(guó)[6]。干紫菜中粗蛋白含量達(dá)30%～50%，富含膳食纖維、多種維生素及鈣、鉀、鎂等微量元素，還含藻類特有的藻膽蛋白，具有抗腫瘤、降血糖、抗衰老等功效[7-9]。但目前主要的加工方式為即食海苔、紫菜湯等，經(jīng)濟(jì)效益低。壇紫菜高蛋白含量使其成為抗高血壓肽的潛在來(lái)源，作為合成ACE抑制劑藥物的替代品[10-11]。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)水解、分離、反復(fù)純化以獲取和鑒定生物活性肽的方法，有耗資較大、周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，基于生物學(xué)查找、篩選活性多肽被引入食源性生物活性肽開發(fā)領(lǐng)域。此外，為了深入探索活性肽與ACE相互作用分子機(jī)制，將分子對(duì)接技術(shù)應(yīng)用于模擬活性肽與ACE分子之間的相互結(jié)合過程。

本研究以壇紫菜為原料，采用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶雙酶聯(lián)合水解壇紫菜蛋白（Porphyra haitanensisprotein，PHP）制備降血壓活性肽，測(cè)定了經(jīng)超濾后各個(gè)分子段清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基能力、鐵離子還原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）以及ACE抑制活性。經(jīng)質(zhì)譜鑒定和活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP以及AHTPDB網(wǎng)站查找篩選活性肽，采用分子對(duì)接解釋多肽抑制ACE機(jī)理，并推導(dǎo)出描述PHP酶解過程規(guī)律的動(dòng)力學(xué)關(guān)系式。本研究有望為壇紫菜深加工與高效利用以及活性肽的鑒定與制備提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜購(gòu)于福建福州永輝超市。

馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、ACE美國(guó)Sigma公司；木瓜蛋白酶（酶活力8.0×105U/g）、糜蛋白酶（1.2×105U/g） 生工生物工程（上海）股份有限公司；DPPH、ABTS及FRAP試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

KH-500DE數(shù)控超聲波清洗儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；A11分析研磨機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；PHB-4 pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Avanti J-26XP臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；LGJ-125冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；RNM-18G超濾設(shè)備 杭州瑞納膜工程有限公司；2695-2698高效液相色譜 美國(guó)Waters公司；Q Exactive Plus組合型四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.1 壇紫菜多肽的制備

將壇紫菜在80 ℃烘干，用超微粉碎機(jī)粉碎過120 目得到壇紫菜粉，用50 倍體積的水浸提4 h得到蛋白粗提物。經(jīng)800 W功率超聲波作用800 s，5 000 r/min離心15 min得到上清液，量取體積，在磁力攪拌下緩慢加入飽和度為40%磨細(xì)的硫酸銨，攪拌過夜，5 000 r/min離心15 min收集沉淀即得較純的PHP。使用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶混合酶（溫度45 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，木瓜蛋白酶0.6 g/L，糜蛋白酶0.4 g/L，pH 8）在自動(dòng)搖床上酶解PHP反應(yīng)12 h，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min收集上清液。80%乙醇溶液醇沉除去多糖和未降解的大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇[12]。并使用超濾裝置分為＜0.5、0.5～1、＜1、1～3、＜3、3～5、＜5、5～100 kDa 8 個(gè)不同分子質(zhì)量的組分。凍干成粉末，置于－80 ℃冰箱保存。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

在96 孔微量培養(yǎng)板中進(jìn)行測(cè)定。每孔加入2 mL的0.015 mmol/L現(xiàn)配DPPH溶液，再加入2 mL的1 mg/mL樣品溶液或者2 mL Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液。微板避光室溫下放置30 min，并使用酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照以相同體積的提取溶劑代替樣品溶液，空白組以相同體積的甲醇溶液代替DPPH溶液。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液配制20、40、60、80、100 μmol/L和120 μmol/L。最終結(jié)果以每1 g樣品凍干粉干質(zhì)量的Trolox當(dāng)量抗氧化能力（μmol/g）表示。

1.3.2.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

使用ABTS試劑盒測(cè)定，在96 孔微量培養(yǎng)板中進(jìn)行。每孔加入170 μL ABTS工作液和20 μL試劑4應(yīng)用液，再加入10 μL 1 mg/mL樣品溶液或者10 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)照以相同體積緩沖液代替樣品溶液，空白組以緩沖液代替ABTS工作液。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mmol/L）稀釋為100、200、400、800、1 000 μmol/L。最終結(jié)果以每1 g樣品凍干粉干質(zhì)量的Trolox當(dāng)量抗氧化能力（μmol/g）表示。

1.3.2.3 FRAP值測(cè)定

測(cè)量在96 孔微量培養(yǎng)板中進(jìn)行。每孔加入180 μL FRAP工作液和20 μL 1 mg/mL樣品溶液或20 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)照以相同體積緩沖液代替樣品溶液，空白組以緩沖液代替FRAP工作液。Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mmol/L）稀釋為100、200、400、800、1 000 μmol/L。最終結(jié)果以每1 g樣品凍干粉干質(zhì)量的Trolox當(dāng)量抗氧化能力（μmol/g）表示。

1.3.3 ACE抑制活性的測(cè)定

參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[13]。反應(yīng)體系總體積為130 μL。測(cè)定管：稱取適量冷凍干燥后的樣品粉末，將其溶于一定量的0.1 mol/L硼酸緩沖溶液（pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl）中，制成1 mg/mL樣品溶液。取樣品溶液60 μL與ACE溶液20 μL混合，37 ℃水浴10 min后加入HHL溶液50 μL；整個(gè)反應(yīng)體系37 ℃水浴60 min后加入1 mol/L HCl溶液100 μL終止反應(yīng)；過0.45 μm濾膜，進(jìn)行液相色譜分析。對(duì)照管：用60 μL硼酸緩沖液（pH 8.3，0.3 mol/L NaCl）替代測(cè)定組樣品溶液。空白對(duì)照管：用20 μL硼酸緩沖液（pH 8.3，0.3 mol/L NaCl）替代對(duì)照組ACE溶液。色譜柱：Waters-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm，流動(dòng)相：80% A（1%甲酸＋1%三氟乙酸＋98%去離子水），20% B（100%乙腈）；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。ACE抑制率計(jì)算如式（1）所示：

式中：[HA]c為對(duì)照樣品馬尿酸濃度；[HA]s為測(cè)定樣品馬尿酸濃度；[HA]H為空白對(duì)照中馬尿酸濃度。

1.3.4 ACE抑制肽序列鑒定

取適量樣本采用C18除鹽柱除鹽后凍干并復(fù)溶于水后，經(jīng)由配備在線納噴離子源的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。整套系統(tǒng)為串聯(lián)EASY-nanoLC 1000的Q Exactive? Plus質(zhì)譜儀。共上樣5 μL樣品（分析柱：Acclaim PepMap C18（75 μm×25 cm）），柱流量控制在300 nL/min，柱溫40 ℃，電噴霧電壓2 kV，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸溶液；B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫：0～3 min，94% A、6% B；3～42 min，94%～80% A、6%～20% B；42～47 min，80%～65% A、20%～35% B；47～60 min，65%～0% A、35%～100% B。質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行，自動(dòng)在質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜集間切換。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：1）質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～500；分辨率：70 000；自動(dòng)增益控制目標(biāo)：3×106；最大進(jìn)樣時(shí)間：50 ms；包括電荷狀態(tài)：2～6。2）HCD-MS/MS分辨率：17 500；隔離窗口：2.0；自動(dòng)增益控制目標(biāo)：1×105；最大進(jìn)樣時(shí)間：45 ms；碰撞能量：28。

1.3.5 分子對(duì)接

參考張婷[14]的方法，通過分子對(duì)接軟件AutoDock 4.2進(jìn)行ACE與活性肽的半柔性分子對(duì)接計(jì)算。配體和受體分子均加上極性氫和kollman電場(chǎng)，之后忽略所有非極性氫，ACE中的Zn2＋需額外加上0.95 e的正電荷。為了提高活性肽與ACE對(duì)接的準(zhǔn)確度，以Zn2＋的空間坐標(biāo)為中心（中心坐標(biāo)為x：43.821，y：38.240，z：46.712）建立了一個(gè)間距0.375 ?、大小100 ?×100 ?×100 ?的反應(yīng)約束盒子。采用拉馬克遺傳算法對(duì)分子對(duì)接能量進(jìn)行優(yōu)化。構(gòu)象能量聚類分析中均方根偏差容忍度為2.0 ?。通過Discovry Studio 4.5對(duì)ACE抑制肽與ACE蛋白分子間相互作用進(jìn)行分析。

1.3.6 活性肽的查找與篩選

降血壓活性肽信息來(lái)自生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）和AHTPDB網(wǎng)站（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpdb/pepsearch.php）。

1.3.7 水解動(dòng)力學(xué)公式的推導(dǎo)及模型的建立

參考Wu Qiongying等[15]的方法。在底物PHP質(zhì)量濃度分別為10、15、20、25 g/L和30 g/L時(shí)，用木瓜蛋白酶和糜蛋白酶雙酶（木瓜蛋白酶0.6 g/L，糜蛋白酶0.4 g/L）水解PHP。考察酶促反應(yīng)過程中水解度（degree of hydrolysis，DH）。為研究酶用量對(duì)DH的影響，采用混合酶在0.4、0.6、0.8 g/L和1.0 g/L酶解質(zhì)量濃度為25 g/L的PHP。其他水解條件為：溫度50 ℃，pH 8.0，水解時(shí)間20～100 min。

推導(dǎo)出的DH與水解時(shí)間關(guān)系方程式如式（2）所示：

式中：a、b為動(dòng)力學(xué)參數(shù)；t為水解時(shí)間/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 PHP酶解液不同分子質(zhì)量組分的抗氧化和ACE抑制活性

根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=－0.000 6X＋0.105 8（R2=0.985 1）計(jì)算，不同分子質(zhì)量PHP酶解液的DPPH自由基清除能力見圖1A。可以看出，＜0.5 kDa組分的DPPH自由基清除能力顯著高于其他組分（P＜0.05）。Chang Chiyue等[16]發(fā)現(xiàn)豬血紅蛋白酶解液低分子質(zhì)量組分相較于高分子質(zhì)量具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。劉冬冬等[17]在使用0.5 kDa的納濾膜截留條斑紫菜的酶解液后發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除能力顯著提高。在PHP提取中可能會(huì)有多酚類物質(zhì)殘留在PHP酶解液。楊小青等[18]在研究羊棲菜不同分子質(zhì)量褐藻多酚的抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，＞30 kDa的乙酸乙酯提取物具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力；Wang Tao等[19]在使用酶促法從紅藻中提取抗氧化成分時(shí)也發(fā)現(xiàn)，＜5 kDa的水提物中含有最高總酚含量從而造成其DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。這可能是5～100 kDa組分酶解液的DPPH自由基清除能力較高，和＜5 kDa組分差異較小的原因。

圖1 不同分子質(zhì)量PHP酶解液DPPH自由基清除能力（A）、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力（B）、FRAP值（C）和ACE抑制活性（D）Fig.1 DPPH radical scavenging capacity (A), ABTS cation radical scavenging capacity (B), FRAP value (C) and ACE inhibitory activity (D) of PHP hydrolysate fractions with different molecular masses

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=－0.000 9X＋1.002 7（R2=0.995 7），不同分子質(zhì)量PHP酶解液對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的影響見圖1B。和DPPH自由基一樣，＜0.5 kDa組分的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最高為544.48 μmol/g，其次是＜1 kDa的組分，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但顯著高于其他分子質(zhì)量的組分（P＜0.05）。這一結(jié)果與Je等[20]的研究一致，抗氧化肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性隨分子質(zhì)量降低而增強(qiáng)。ABTS陽(yáng)離子自由基是一種人工合成的親水性自由基，隨著分子質(zhì)量的降低，抗氧化肽的親水性不斷增強(qiáng)，所以小分子抗氧化肽更易進(jìn)入反應(yīng)體系，進(jìn)而與ABTS陽(yáng)離子自由基發(fā)生反應(yīng)。

FRAP方法下Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.002 5X＋0.172（R2=0.991 4），不同分子質(zhì)量PHP酶解液的FRAP值見圖1C。不同于DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基，＜1 kDa組分的FRAP值最高，而不是＜0.5 kDa組分。這說(shuō)明FRAP值可能和分子質(zhì)量不呈絕對(duì)的負(fù)相關(guān)。Alemán等[21]在研究魷魚明膠水解物中多肽的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，將10 kDa的組分再細(xì)分成4 個(gè)組分，并不是分子質(zhì)量最小的組分Fe3＋還原能力最高。Wiriyaphan等[22]也發(fā)現(xiàn)魚糜副產(chǎn)物的酶解物中1～5 kDa的短肽相較于＜1 kDa、5～30 kDa和＞30 kDa的組分具有最高的抗氧化活性。因此，推斷PHP酶解液中抗氧化肽的Fe3＋還原力與其分子質(zhì)量關(guān)系為：分子質(zhì)量太大或太小，抗氧化肽的還原活性都不高，適中分子質(zhì)量范圍（1～5 kDa）的活性肽的還原能力較高。

PHP分段酶解液對(duì)ACE的抑制效果如圖1D所示。可以看出，隨著酶解液分子質(zhì)量的不斷增大，IC50值也越來(lái)越大，即ACE抑制活性越來(lái)越低。＜0.5 kDa和0.5～1 kDa酶解液的IC50值顯著低于其他分子質(zhì)量組分（P＜0.05），說(shuō)明在PHP酶解液中具有較強(qiáng)的ACE抑制活性的多肽集中在1 kDa分子質(zhì)量以下。曹文紅[23]在研究中國(guó)毛蝦酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量與ACE抑制活性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制活性最強(qiáng)的組分在311～1 320 Da之間。鄧真真[24]使用5種酶酶解PHP發(fā)現(xiàn)，不管使用哪一種酶酶解，＜1 kDa的組分IC50值均低于1～3 kDa和＞3 kDa。分析其原因是ACE活性中心通常具有一定的空間結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量較大的多肽不能進(jìn)入活性中心的狹小空間與ACE活性部位氨基酸有效結(jié)合，進(jìn)而不能干擾ACE與底物血管緊張素I的結(jié)合，發(fā)揮降血壓的活性；而分子質(zhì)量較小的多肽能夠插入活性部位的裂隙中，并與催化相關(guān)的氨基酸結(jié)合，從而干擾ACE催化底物[25-26]。＜1 kDa組分的IC50值為（2.21±0.28）mg/mL，質(zhì)譜鑒定選擇這一組分。

2.2 ACE抑制肽序列鑒定結(jié)果

LDY（Leu-Asp-Tyr）的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖2A所示，其中y1（m/z182.081 1）表明該條肽段的C端氨基酸殘基為Tyr，氨基酸殘基Aspm/z為y2－y1=115.026 6，而N端殘基為L(zhǎng)eu（m/zb2－115.026 6=114.091 6）。類似的，二級(jí)質(zhì)譜圖4B為AVP（Ala-Val-Pro），圖4C為GPL（Gly-Pro-Leu），圖4D為L(zhǎng)GYL（Leu-Gly-Tyr-Leu），有誤差的為部分減水、減氫、減氨基導(dǎo)致。

圖2 4 條多肽的二級(jí)質(zhì)譜圖和氨基酸序列Fig.2 Secondary mass spectra and amino acid sequences of four peptides

圖4 不同底物質(zhì)量濃度（A）和酶質(zhì)量濃度（B）PHP的水解曲線以及a值與E0/S0值的線性關(guān)系圖（C）Fig.4 Hydrolysis curves of PHP with different substrate concentrations (A) and enzyme concentrations (B), and linear relationship between a and E0/S0 (C)

2.3 分子對(duì)接與壇紫菜ACE抑制肽的抑制機(jī)理解析

活性肽和ACE相互作用關(guān)系的探討有助于對(duì)ACE抑制活性機(jī)理做進(jìn)一步解析。使用Autodock 4.2對(duì)接軟件將質(zhì)譜鑒定和降血壓肽庫(kù)對(duì)比選出的14 條短肽與ACE進(jìn)行對(duì)接。圖3為文獻(xiàn)報(bào)道中具有顯著ACE抑制活性的4 條短肽與ACE的對(duì)接結(jié)果。已有研究表明，氫鍵相互作用在穩(wěn)定對(duì)接復(fù)合體和酶催化反應(yīng)中起最重要的作用[27]。如圖3A所示，LDY與ACE的Asp377、Ala354、Glu384、Asp415和Gln281形成了5 個(gè)傳統(tǒng)氫鍵，與Tyr523形成了1 個(gè)Pi-供體氫鍵，其對(duì)接能量值為－7.65 kJ/mol。同樣的，根據(jù)圖3B，AVP與ACE的2 個(gè)殘基Asp415和Gln281形成了3 個(gè)傳統(tǒng)氫鍵，與His513和Tyr520形成了2 個(gè)碳?xì)滏I，其對(duì)接能量值為－5.87 kJ/mol。根據(jù)圖3C，GPL與ACE的Lys511、Gln281、Tyr520和Asp415殘基形成了5 個(gè)傳統(tǒng)氫鍵，與His353形成了1 個(gè)碳?xì)滏I，其對(duì)接能量值為－6.13 kJ/mol。如圖3D所示，LGYL與ACE的Cys352、Glu162、Gln281以及Asn277形成了4 個(gè)傳統(tǒng)氫鍵，與Thr282和Glu376形成了3 個(gè)碳?xì)滏I，其對(duì)接能量為－7.78 kJ/mol。

圖3 多肽與ACE的對(duì)接結(jié)果Fig.3 Molecular docking between ACE and peptides

降血壓活性肽主要通過氫鍵相互作用、范德華力以及靜電相互作用與ACE結(jié)合，進(jìn)而抑制ACE活性，其中以氫鍵相互作用尤為重要，可起到穩(wěn)定對(duì)接復(fù)合物的作用，且氫鍵數(shù)目直接影響了降血壓活性肽對(duì)ACE的親和力，而氫鍵數(shù)目又與活性肽的氨基酸構(gòu)成緊密聯(lián)系[28]。LDY、AVP、GPL和LGYL都具有較多氫鍵和較低對(duì)接能量值，C端氨基酸分別為Pro（P）、Leu（L）、Tyr（Y）和Leu（L），這些氨基酸都是疏水或芳香族氨基酸。這與先前的研究結(jié)果[11]一致。在純化鑒定海帶中的降血壓肽發(fā)現(xiàn)，KKFY和SKTY分別與ACE活性口袋的不同殘基部位形成了13 個(gè)和9 個(gè)氫鍵，具有很強(qiáng)的ACE抑制活性。這些結(jié)果一致表明，C端氨基酸的種類及位置對(duì)多肽的ACE抑制活性影響至關(guān)重要，C末端的疏水或芳香氨基酸殘基或Pro（P）對(duì)ACE抑制活性的提高有積極作用。

2.4 PHP的雙酶水解動(dòng)力學(xué)

由PHP的水解曲線可以看出，DH隨著底物質(zhì)量濃度的增加而降低（圖4A），隨著酶質(zhì)量濃度的增加而升高（圖4B）。結(jié)果表明，酶底比對(duì)PHP的DH有很大的影響。從圖4可以看出，PHP的DH在40 min迅速升高，然后在40～100 min緩慢升高，這與脫脂小麥胚芽蛋白[29]和刺鰩明膠[30]的水解曲線相似。如表1所示，動(dòng)力學(xué)參數(shù)a隨底物質(zhì)量濃度的增加而降低，隨酶質(zhì)量濃度的增加而增加。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，動(dòng)力學(xué)參數(shù)a不是常數(shù)，它隨酶和底物質(zhì)量濃度的變化而變化。然而，酶和底物質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)b的影響不遵循一個(gè)確定的趨勢(shì)（增加或減少），接近一個(gè)常數(shù)，在其平均值0.244附近上下波動(dòng)。Wu Qiongying等[15]報(bào)道了甜高粱籽粒蛋白水解動(dòng)力學(xué)參數(shù)b的變化范圍很小。因此在一個(gè)恒溫水解反應(yīng)中，b可以看作是一個(gè)常數(shù)，取其平均值。Valencia等[31]也報(bào)道了相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三文魚肌肉蛋白水解動(dòng)力學(xué)參數(shù)b的值比a更穩(wěn)定。通過對(duì)a值與E0/S0值作圖，發(fā)現(xiàn)a與E0/S0呈線性關(guān)系如圖4C所示。當(dāng)時(shí)，等式y(tǒng)＝63.23x－0.24就可以表示為a＝63.23E0/S0－0.24。將等式代入式（2），則DH和t的關(guān)系式就可以表示為：

表1 酶和底物質(zhì)量濃度對(duì)PHP水解a、b值的影響Table 1 Effect of enzyme and substrate concentrations on a and b values of PHP hydrolysis

對(duì)于酶解過程，從反應(yīng)機(jī)理出發(fā)，推導(dǎo)出描述蛋白可控酶解過程規(guī)律的動(dòng)力學(xué)關(guān)系式，建立符合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)于加深對(duì)影響蛋白質(zhì)水解過程因素的理解及指導(dǎo)實(shí)踐有實(shí)際意義[32]。為了驗(yàn)證所建立動(dòng)力學(xué)模型的有效性，在不同酶質(zhì)量濃度和底物質(zhì)量濃度下進(jìn)行3 個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，如圖5A所示。預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的比較表明，所有的相對(duì)誤差均在10%以下。除水解曲線擬合良好（圖5A）外，預(yù)測(cè)DH值與實(shí)驗(yàn)DH值之間的相關(guān)關(guān)系也表現(xiàn)出良好的線性回歸系數(shù)，其中當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度6 g/L、酶質(zhì)量濃度0.5 g/L時(shí)R2為0.998 72（圖5B），當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度20 g/L、酶質(zhì)量濃度1.2 g/L時(shí)R2為0.998 56（圖5C），當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度12 g/L、酶質(zhì)量濃度0.4 g/L時(shí)R2為0.999 38（圖5D）。這一驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)了動(dòng)力學(xué)模型的統(tǒng)計(jì)意義，表明該模型可靠，可以從操作條件表征和描述PHP的酶解過程。

圖5 DH預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值比較與相關(guān)性Fig.5 Comparison and correlation between predicted and experimental values for the degree of hydrolysis

3 結(jié) 論

目前，活性多肽的制備路線基本上遵循蛋白質(zhì)提取→不同酶的水解及條件優(yōu)化→反復(fù)分離純化→活性測(cè)定→結(jié)構(gòu)鑒定這一路線，不僅耗時(shí)耗力，而且在反復(fù)分離純化過程中活性肽損失嚴(yán)重。所以，基于生物信息學(xué)同實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法正成為今后的研究熱點(diǎn)。本研究采用基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接技術(shù)，通過生物信息篩選和體外活性檢測(cè)從PHP酶解液中快速鑒定、篩選活性多肽。活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明PHP酶解液小于0.5 kDa組分具有最高的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，小于1 kDa組分具有最高的FRAP值，而分子質(zhì)量0.5～1 kDa組分具有最高的抑制ACE活性。AVP、GPL、LDY和LGYL 4 條短肽與ACE的分子對(duì)接結(jié)果表明，多肽主要通過與ACE的活性口袋和氨基酸殘基形成氫鍵進(jìn)而抑制ACE活性，且多肽C末端氨基酸為疏水、芳香氨基酸或Pro（P）時(shí)對(duì)ACE抑制活性的提高有積極作用。雙酶水解動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)DH與實(shí)驗(yàn)DH的相對(duì)誤差均在10%以下。本實(shí)驗(yàn)為深度開發(fā)活性肽的高價(jià)值利用和蛋白的可控酶解提供了參考與借鑒。