海藻糖脂肪酸二酯的酶法合成及性質

汪淑珍

（暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632）

海藻糖是一類廣泛分布于蝦、藻類及酵母等生物中的天然二糖，其結構以兩分子葡萄糖通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成[1]。除了作為各類生物的結構及能量物質外[2]，海藻糖還具有一些極佳的功能性質。例如，馬路凱等[3]在冷凍熟制水產品中添加海藻糖作為保水劑，發揮抗凍保水的作用；Vílchez等[4]對土豆和辣椒接種一組耐干旱微生物菌株，通過該菌株產生的海藻糖可保護植物免受干旱，從而使植物具有抗干旱的能力；Lee等[5]研究發現蛋白類藥物中添加海藻糖水凝膠可維持其在運輸和長期貯藏過程中的穩定性。同時，海藻糖的親水性羥基易與各類脂肪酸構成海藻糖酯，提升其乳化[6]、膠凝[7-8]、流變[9]及賦形[10]等理化性能，以及抗菌[11-12]、抗生物膜形成[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化[2,14]及抗炎[11]等生物活性，并且海藻糖酯自身無毒無刺激、易降解等特性，擴大了其在食品[9]、藥品[15-17]、化妝品[18]等領域的應用范圍。

海藻糖酯可通過酯化或酯交換反應進行化學或酶催化合成。其中，化學催化合成因反應過程中酰氯或毒性偶聯劑的殘留、苛刻的工藝參數及副產物的產生等不利因素逐漸被摒棄[11]。Paul等[19]以2-(1H-苯并三偶氮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate，TBTU）為偶聯劑合成海藻糖單酯和二酯的混合物，不僅分離純化困難，而且TBTU的使用也容易造成環境危害。而酶催化合成因具有反應條件溫和、選擇性高和操作簡單等優點引發了研究者們極大的興趣[20]。在酶種類篩選過程中發現，脂肪酶[6]和蛋白酶[21]具有選擇特異性及催化效率高等特點，常作為酶促反應催化劑用于海藻糖酯的合成。其中，脂肪酶通常選擇性作用于己糖苷的伯羥基合成特異性糖酯[22]，且廣泛來源于植物、動物和微生物[23]。據文獻報道，微生物來源的南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B，CALB）常用于海藻糖酯的合成并獲得較高的得率[8,22]。而固定化CALB如固定化脂肪酶Novozym 435[14,24]和Fermase CALB? 10000[11]等不僅易于合成海藻糖酯，而且還易于從反應混合物中分離[25]。在固定化脂肪酶催化下合成糖酯時，由于糖類和脂肪酸直接酯化脫水縮合生成副產物水，而極少量的水亦能在酶表面形成單層水，干擾酶活性位點的底物結合，因此水起到競爭性抑制劑作用，促進水解這一逆反應，導致得率降低[6,26]。Marathe等[11]通過酯化反應將海藻糖轉化為其棕櫚酸酯，轉化率僅為35%，且產物為單酯和二酯的混合物，還需要后續分離和純化。

因此，目前常用的海藻糖酯合成方法，是通過海藻糖與脂肪酸乙烯酯發生不可逆的酯交換反應，即以脂肪酸乙烯酯為酰基供體，生成易從反應介質中除去的乙醛（在室溫下為氣體），有效使反應平衡向酯生成方向移動，具有較高的反應速率和得率[27-28]。據報道，Hibert等[8]使用合成的脂肪酸乙烯酯與海藻糖發生酯交換反應生成海藻糖脂肪酸二酯，得率可達到50%。對于酯交換反應，有機溶劑等非水介質的加入通常有利于反應的進行，然而，極性有機溶劑雖提高了反應底物的溶解度，但易使酶失活，而非極性有機溶劑雖有助于保持酶活力但會使二糖溶解度降低。為了解決這一矛盾，可采用混合溶劑以兼顧糖類反應物的溶解性和酶活力的保持。Chen Jie等[29]在吡啶和叔丁醇（4∶6，V/V）的混合溶劑中，通過CALB催化合成海藻糖亞油酸單酯的產物濃度可達近20 mmol/L。

本研究擬通過在混合溶劑中，探究海藻糖和常見C6～C18脂肪酸乙烯酯在固定化脂肪酶催化下選擇性合成相應6,6’-O-海藻糖脂肪酸二酯的最佳條件。通過核磁共振波譜和質譜分析鑒定產物結構，測定系列海藻糖脂肪酸二酯的親水親油平衡（hydrophilic lipophilic balance，HLB）值、發泡性能、熱穩定性以及細胞毒性，以期為海藻糖脂肪酸二酯的合成提供一種綠色有效的新方法，評價其作為穩定的O/W型食品乳化劑的應用前景，為其綜合利用原料和開發具有價值的新型糖酯提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠巨噬細胞RAW267.4、人高轉移肝癌細胞HCCLM3、人肝癌細胞HepG2、宮頸癌細胞Hela、人肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7 中國科學院細胞庫。

乙酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯、Span 20、油酸、醋酸鈀 東京化學工業有限公司；海藻糖、吡啶、叔丁醇、阿霉素 薩恩化學技術（上海）有限公司；Novozym 435固定化脂肪酶 諾維信生物技術（上海）有限公司；氫氧化鉀 天津市福晨化學試劑廠；蔗糖酯S-1170 日本三菱化學食品公司：柱層析硅膠、薄層層析板 青島海洋化工有限公司；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（均為分析純） 廣州市光華科技股份有限公司；氘代氯仿、氘代甲醇 美國CIL公司。

1.2 儀器與設備

EL104電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；MS-H-Pro磁力攪拌器 美國賽洛捷克公司；N-1300型旋轉蒸發器 東京理化器械株式會社；AVANCE III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀（300、400、500 MHz和600 MHz） 瑞士布魯克公司；4000 Q-Trap-質譜（mass spectrometry，MS）儀 美國應用生物系統公司；T25高速剪切機 德國IKA公司；TG209F3-ASC熱重分析儀 德國耐馳公司；96 孔聚苯乙烯微孔板 美國康寧公司；SynergyTMHT多功能酶標儀 美國博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油酸乙烯酯的合成

1.3.1.1 化學合成油酸乙烯酯

在500 mL圓底燒瓶中依次加入36.2 mmol油酸、140.0 g乙酸乙烯酯、0.04 g醋酸鈀、0.2 g氫氧化鉀。室溫、氮氣保護下混合攪拌反應30 h（圖1）[30]。

圖1 油酸乙烯酯的化學合成Fig.1 Chemical synthesis of oleic acid vinyl esters

1.3.1.2 薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法定性分析油酸乙烯酯

TLC法是根據不同化合物極性不同，通過流動相時遷移速率不同，從而將樣品中各組分按極性大小展開，通過顯色劑顯色后測定各組分斑點的遷移率（Rf）定性分析目標產物。

用毛細管取反應結束后的混合物和經硅膠柱層析收集的粗分離液，在薄層層析板上點樣，以體積比9∶1的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開至溶劑前沿取出，待展開劑揮發完后，用堿性高錳酸鉀顯色，斑點為亮黃色。按式（1）計算各組分斑點的Rf值：

1.3.1.3 硅膠柱層析分離純化油酸乙烯酯

反應結束后，先在45 ℃下旋轉蒸發除去多余的乙酸乙烯酯，再取硅膠，用石油醚濕法裝柱，用體積比490∶10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，TLC監測，收集目標產物，濃縮得到所需的油酸乙烯酯。按式（2）計算油酸乙烯酯得率：

1.3.1.4 油酸乙烯酯結構鑒定

1H NMR、13C NMR檢測條件：氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷為內標，25 ℃下分別采用300 MHz和101 MHz進行數據收集。

1.3.2 海藻糖脂肪酸二酯的合成

1.3.2.1 酶法合成海藻糖脂肪酸二酯

參考Li Xuan等[31]的棉子糖脂肪酸酯合成方法并加以改進。將2.0 g海藻糖溶解于65 mL無水吡啶中，然后添加80 mL預熱至60 ℃的無水叔丁醇；加入2.0 g固定化脂肪酶Novozym 435，并在60 ℃下通過磁力攪拌器攪拌懸浮液（250 r/min、30 min）；最后按照海藻糖和脂肪酸乙烯酯物質的量比為1∶4加入相應的脂肪酸乙烯酯（23.2 mmol），反應72 h，具體過程如圖2所示。

圖2 海藻糖脂肪酸二酯的酶促合成Fig.2 Enzymatic synthesis of trehalose fatty acid diesters

1.3.2.2 TLC法定性分析海藻糖脂肪酸二酯

按1.3.1.2節步驟用TLC法進行海藻糖脂肪酸二酯定性分析，展開劑為體積比4∶1的二氯甲烷-甲醇。

1.3.2.3 硅膠柱層析分離純化海藻糖脂肪酸二酯

反應結束后，先在55 ℃下旋轉蒸發除去多余溶劑，再過濾濃縮得到黃色油狀粗產物，最后取硅膠，用二氯甲烷濕法裝柱，體積比9∶1的二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脫，TLC監測，收集目標產物，濃縮得到所需的海藻糖脂肪酸二酯。按式（3）計算海藻糖脂肪酸二酯得率：

1.3.2.4 海藻糖脂肪酸二酯結構鑒定

1H NMR、13C NMR檢測條件：氘代甲醇為溶劑，25 ℃下分別采用600 MHz和151 MHz（海藻糖棕櫚酸二酯分別采用500 MHz和126 MHz）進行數據收集。

用單四極桿液相色譜-MS儀用于獲取低分辨率MS。MS條件：電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）離子源，正離子模式檢測，氣簾氣壓力20 psi，去溶劑溫度0 ℃，霧化氣壓力20 psi，加熱氣壓力0 psi，噴霧電壓5 500 V，去簇電壓50 V，射入電壓10 V；質量掃描范圍m/z50～1 800；掃描時間1.750 s。

1.3.3 海藻糖脂肪酸二酯的HLB值計算

HLB值由表面活性劑分子中所含的親水基團和疏水基團的物質的量決定。按式（4）計算海藻糖脂肪酸二酯的HLB值[32]：

1.3.4 海藻糖脂肪酸二酯的起泡性和泡沫穩定性測定

稱取一定量的系列海藻糖脂肪酸二酯溶液及對照物S-1170和Span20于100 mL離心管中，25 ℃下用蒸餾水配制質量濃度均為0.2 g/100 mL的溶液，記錄溶液起始高度（h0）。用高速剪切機于2 000×g下分散均質2 min，立即測定每組樣品的泡沫高度（h2）和液體總高度（h1），分別于靜置20、40、60 min和80 min后記錄泡沫高度（h3）[31]。分別按式（5）、（6）計算起泡性和泡沫穩定性：

1.3.5 海藻糖脂肪酸二酯的熱重分析

將10 mg的系列海藻糖脂肪酸二酯及對照物S-1170置于氮氣保護的Al2O3坩堝中，使用熱重分析儀分析樣品，溫度范圍50～350 ℃，升溫速率為10 ℃/min。記錄在該加熱過程中每個樣品的質量隨溫度的變化值。

1.3.6 海藻糖脂肪酸二酯的細胞毒性測定

以阿霉素為對照，選取鼠巨噬RAW267.4、人高轉移肝癌HCCLM3、人肝癌HepG2、宮頸癌Hela、人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7這6種細胞系，采用噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法評價海藻糖脂肪酸二酯的細胞毒性。6種不同的細胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養，在37 ℃、5% CO2環境中培養12 h，移除培養基，將細胞以5 000～15 000 個/孔的密度接種到96 孔細胞培養板中，并分別與不同濃度（0、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L）待測系列海藻糖脂肪酸二酯及阿霉素共同孵育24 h。分別向培養基中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃、5% CO2潮濕環境中繼續孵育4 h，除去培養基，將產生的甲臜晶體溶解于200 μL二甲基亞砜中，使用酶標儀在570 nm波長處測定溶液吸光度[33]。以不添加樣品及阿霉素為空白組，以樣品濃度為橫坐標，細胞活性抑制率為縱坐標，計算半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），細胞毒性結果以IC50表示。細胞活性抑制率按式（7）計算：

式中：A實驗為樣品組吸光度；A空白為空白組吸光度。

1.4 數據處理與分析

采用ChemBioOffice 2019軟件繪制化合物結構式；采用MestReNova 12.0軟件進行化合物的譜圖解析、結構確證；采用Excel 2016軟件進行圖表處理。采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析，所有實驗均重復3 次，結果表示為±s。采用方差分析及Duncan多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 油酸乙烯酯及海藻糖脂肪酸二酯的合成得率及結構鑒定

2.1.1 油酸乙烯酯的合成得率及結構鑒定

采用化學合成方法，經硅膠柱層析純化反應產物，產物為透明油狀液體，通過Rf值定性及NMR分析鑒定其結構即為油酸乙烯酯，經計算油酸乙烯酯的合成得率約為88%。

1H-NMR和13C-NMR鑒定結果如下：

1H NMR（300 MHz，氘代氯仿-D）：δ7.28（dd，J＝14.0、6.3 Hz，1H，—CH＝CH2）、5.41～5.26 （m，2H，—CH＝CH—）、4.86（dd，J＝14.0、1.5 Hz，1H，—CH＝CH2）、4.55（dd，J＝6.3、1.5 Hz，1H，—CH＝CH2）、2.37（t，J＝7.5 Hz，2H，—CH2CO—）、2.21～1.86（m，4H，—CH2CH＝CHCH2—）、1.71～1.59（m，2H，—CH2CH2CO—）、1.32～1.24（m，20H，—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)6CH3）、0.86（t，J＝0.6 Hz，3H，—CH3）。加粗表示信號峰位置，下同。

13C NMR（101 MHz，氘代氯仿-D）：δ170.97（C＝O）、141.32（—CH＝CH2）、130.14、129.83（—CH＝CH—）、97.52（—CH＝CH2）、34.05（—CH2CO—）、32.04（—CH2CH2CH3）、29.90、29.80、29.66、29.46（×2）、29.25、29.19、29.15（—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)4(CH2)2CH3）、27.35、27.28（—CH2CH＝CHCH2—）、24.72（—CH2CH2CO—）、22.82（—CH2CH3）、14.25（—CH3）。

2.1.2 海藻糖己酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與己酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖己酸二酯的合成得率約為58%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.04（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.2 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.2、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.74～3.81（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.59（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.38～1.29（m，8H，2×—(CH2)2CH3）、0.92（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.47（2×C＝O）、95.26（C-1，C-1’）、74.54（C-3，C-3’）、73.15（C-2，C-2’）、71.88（C-5，C-5’）、71.49（C-4，C-4’）、64.36（C-6，C-6’）、35.00（2×—CH2CO—）、32.40（2×—CH2CH2CH3）、25.76（2×—CH2CH2CO—）、23.40（2×—CH2CH3）、14.28（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z556.3（[M＋NH4]＋，100%）、561.3（[M＋Na]＋，90%）。

2.1.3 海藻糖辛酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與辛酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖辛酸二酯的合成得率約為45%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.04（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.35（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.3 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.02（ddd，J＝10.1，5.2、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.74（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.67～1.58（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.39～1.26（m，16H，2×—(CH2)4CH3）、0.91（t，J＝7.1 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.48（2×C＝O）、95.25（C-1，C-1’）、74.54（C-3，C-3’）、73.15（C-2，C-2’）、71.89（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.40（C-6，C-6’）、35.05（2×—CH2CO—）、32.86（2×—CH2CH2CH3）、30.16, 30.10（2×—(CH2)2CH2CH3）、26.07（2×—CH2CH2CO—）、23.68（2×—CH2CH3）、14.43（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z612.3（[M＋NH4]＋，100%）、617.3（[M＋Na]＋，70%）。

2.1.4 海藻糖癸酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與癸酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖癸酸二酯的合成得率約為75%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.04（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.35（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.3 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.02（ddd，J＝10.1、5.3、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.82～3.74（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz,，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.58（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.39～1.27（m，24H，2×—(CH2)6CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.46（2×C＝O）、95.24（C-1，C-1’）、74.55（C-3，C-3’）、73.15（C-2，C-2’）、71.91（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.41（C-6，C-6’）、35.06（2×—CH2CO—）、33.05（2×—CH2CH2CH3）、30.58、30.43（×2）、30.20（2×—(CH2)4CH2CH3）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.74（2×—CH2CH3）、14.46（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z668.4（[M＋NH4]＋，100%）、673.4（[M＋Na]＋，90%）。

2.1.5 海藻糖月桂酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與月桂酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖月桂酸二酯的合成得率約為54%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（600 MH，氘代甲醇-D4）：δ5.05（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.3、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.82～3.75（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.57（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.37～1.26（m，32H，2×—(CH2)8CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.46（2×C＝O）、95.22（C-1，C-1’）、74.55（C-3，C-3’）、73.16（C-2，C-2’）、71.92（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.42（C-6，C-6’）、35.06（2×—CH2CO—）、33.09（2×—CH2CH2CH3）、30.76、30.62、30.50、30.44（×2）、30.21（2×—(CH2)6CH2CH3）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.75（2×—CH2CH3）、14.46（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z724.5（[M＋NH4]＋，100%）、729.5（[M＋Na]＋，50%）。

2.1.6 海藻糖肉豆蔻酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與肉豆蔻酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖肉豆蔻酸二酯的合成得率約為62%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.05（d，J＝3.7 Hz，2H，H-1, H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.3、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.73（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.5，1.5 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.58（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.35～1.26（m，40H，2×—(CH2)10CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.46（2×C＝O）、95.20（C-1，C-1’）、74.56（C-3，C-3’）、73.16（C-2，C-2’）、71.93（C-5，C-5’）、71.48（C-4，C-4’）、64.42（C-6，C-6’）、35.08（2×—CH2CO—）、33.10（2×—CH2CH2CH3）、30.83、30.79、30.76、30.63、30.50、30.44（×2）、30.21（2×—(CH2)8CH2CH3）、26.09（2×—CH2CH2CO—）、23.75（2×—CH2CH3）、14.46（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z780.6（[M＋NH4]＋，100%）、785.5（[M＋Na]＋，50%）。

2.1.7 海藻糖棕櫚酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與棕櫚酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖棕櫚酸二酯的合成得率約為43%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（500 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.05（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.8、2.3 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.21（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.02（ddd，J＝10.3、5.4、2.2 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.74（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.8、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝9.5 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.68～1.56（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.36～1.28（m，48H，2×—(CH2)12CH3）、0.90（t，J＝6.7 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（126 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.48（2×C＝O）、95.29（C-1，C-1’）、74.70（C-3，C-3’）、73.24（C-2，C-2’）、72.02（C-5，C-5’）、71.56（C-4, C-4’）、64.49（C-6，C-6’）、35.12（2×—CH2CO—）、33.03（2×—CH2CH2CH3）、30.74（×3）、30.71（×2）、30.69、30.56、30.41、30.36、30.18（2×—(CH2)10CH2CH3）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.67（2×—CH2CH3）、14.36（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z836.7（[M＋NH4]＋，100%）、841.5（[M＋Na]＋，30%）。

2.1.8 海藻糖油酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與油酸乙烯酯反應72 h，硅膠柱層析分離純化，經計算海藻糖油酸二酯的合成得率約為50%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.35（t，J＝4.7 Hz，4H，2×—CH＝CH—）、5.05（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.3、2.0 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.69（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、2.12～1.95（m，8H，2×—CH2CH＝CHCH2—）、1.66～1.59（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.38～1.27（m，40H，2×—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)6CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.40（2×C＝O）、130.91、130.81（—CH＝CH—）、95.18（C-1，C-1’）、74.56（C-3，C-3’）、73.16（C-2，C-2’）、71.93（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.43（C-6，C-6’）、35.07（2×—CH2CO—）、33.08（2×—CH2CH2CH3）、30.87、30.83、30.64、30.47、30.37、30.32、30.21、30.20（2×—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)4(CH2)2CH3）、28.16（2×—CH2CH＝CHCH2—）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.76（2×—CH2CH3）、14.48（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z888.7（[M＋NH4]＋，100%）、893.7（[M＋Na]＋，30%）。

據文獻報道，固定化脂肪酶Novozym 435是催化海藻糖酯合成的最優生物催化劑[6,14]。因此，本方法采用固定化脂肪酶Novozym435，在60 ℃下催化合成海藻糖脂肪酸二酯。為獲得理想的得率，采用4 倍海藻糖物質的量的脂肪酸乙烯酯為酰基供體與海藻糖發生酯交換反應，并產生易從反應中除去的乙醛，使反應正向進行[27]。據Chen Jie等[29]報道，在吡啶和叔丁醇的混合溶劑中，海藻糖溶解度較高且對酶活性影響較小，因此本研究選擇在吡啶和叔丁醇的混合溶劑中反應72 h。所得產物為白色無定形固體物質，且海藻糖脂肪酸二酯是唯一產物。這是因為海藻糖是對稱分子，其6及6’位羥基的空間位阻小于其他位點，而固定化脂肪酶Novozym 435對海藻糖的催化位點具有選擇性[27]。實驗所制備系列海藻糖脂肪酸二酯的得率為43%～75%，其中海藻糖癸酸二酯的得率最高（75%），而海藻糖棕櫚酸二酯的得率最低（43%），說明脂肪酸乙烯酯的碳鏈越長，得率越低。這可能是由于長鏈脂肪酸乙烯酯在混合溶劑中的溶解度較低及空間位阻較大，導致反應相對困難，從而降低了其得率[6]。

油酸乙烯酯及系列海藻糖脂肪酸二酯的結構先由TLC定性分析，再由NMR數據鑒定。其中，1H NMR確證了油酸乙烯酯分別對應于δ4.55、4.86、7.28處的乙烯基質子峰，而δ5.41～5.26處信號峰主要歸因于[—CH＝CH—]基團[27]。以海藻糖己酸二酯為例，其TLC定性分析的Rf值約為0.17，在1H NMR中，脂肪酸鏈中甲基信號的質子峰出現在δ0.92處，與羰基相連的亞甲基[—CH2(C＝O)O—]信號峰出現在δ2.34處，在δ4.20、4.36處的峰歸因于（H-6b，H-6b’）和（H-6a，H-6a’），在δ5.04處的信號峰對應于海藻糖部分中的（H-1，H-1’）。在13C NMR中，[—CH3]基團的化學位移為δ14.28，[—CH2—CO—]基團的化學位移為δ35.00，在δ95.26處的信號為（C1，C1’），在δ175.47處的信號可歸因于羰基[—CH2(C＝O)O—]。綜上，確證其為海藻糖己酸二酯[6]。同理，通過TLC、1H NMR和13C NMR可確證海藻糖辛酸二酯、海藻糖癸酸二酯、海藻糖月桂酸二酯、海藻糖肉豆蔻酸二酯、海藻糖棕櫚酸二酯，而海藻糖油酸二酯需再結合1H NMR中δ5.35處歸因于[—CH＝CH—]基團的信號峰及13C NMR中δ130.81、130.91處歸因于[—CH＝CH—]的信號峰進一步確證。

如圖3所示，以海藻糖月桂酸二酯為代表，通過1H異核多鍵相關譜確認海藻糖脂肪酸二酯的酰化位置。海藻糖月桂酸二酯C-6和C-6’位的亞甲基質子與酯部分的羰基碳相互作用，從而建立酯化位點，同時允許其他關鍵相互作用與海藻糖和側鏈亞結構相關的非羥基質子進行共振分配。

圖3 海藻糖月桂酸二酯的1H異核多鍵相關譜圖Fig.3 1H Heteronuclear multi-bond correlation spectrum of trehalose dilaurate

由MS分析結果可知，具有不同碳鏈長度（C6～C18）的7種海藻糖脂肪酸二酯的分子質量在正離子模式下分別在m/z556.3、612.3、668.4、724.5、780.6、836.7、888.7觀察到其加合分子離子[M＋NH4]＋，及m/z561.3、617.3、673.4、729.5、785.5、841.5、893.7處觀察到其加合分子離子[M＋Na]＋。這與系列海藻糖脂肪酸二酯分子質量理論值保持一致，進一步確定其為所需海藻糖脂肪酸二酯。

2.2 海藻糖脂肪酸二酯的HLB值

由圖4可知，隨著脂肪酸鏈碳原子數的增加（C6～C18），海藻糖脂肪酸二酯側鏈越長，其HLB值越低。一般而言，HLB值3～6為W/O型表面活性劑，HLB值8～18為O/W型表面活性劑。本實驗中系列海藻糖脂肪酸二酯HLB值為8～13，表明其可能具有作為O/W型表面活性劑應用于食品等領域的潛力。

圖4 系列海藻糖脂肪酸二酯的HLB值Fig.4 HLB values of trehalose fatty acid diesters

2.3 海藻糖脂肪酸二酯的起泡性和泡沫穩定性

糖酯的發泡性能通常根據其起泡性（形成泡沫的能力）和泡沫穩定性（保持泡沫的能力）評估，受質量濃度、溶解度、脂肪酸鏈長和糖類型等因素影響[34]。如圖5A所示，質量濃度為0.2 g/100 mL時，隨碳原子數的增加，海藻糖脂肪酸二酯起泡性逐漸增加（P＜0.05），海藻糖癸酸二酯的起泡性達到101.00%，海藻糖月桂酸二酯的起泡性最佳（142.67%）；然而，隨著碳鏈長度進一步延長，起泡性開始下降（P＜0.05），如海藻糖棕櫚酸二酯和海藻糖油酸二酯這類具有較長烷基側鏈的海藻糖脂肪酸二酯幾乎沒有起泡性（分別為5.00%和3.67%），甚至略低于對照物（Span 20和S-1170分別為6.33%和5.67%）。值得注意的是，酰基側鏈最短的海藻糖己酸二酯未表現出起泡性，這可能是由于其親水性較高，導致表面活性降低，起泡性亦隨之變差[31]，這與其較高的HLB值結果一致。此外，隨著碳鏈長度的延長，海藻糖脂肪酸二酯的分子質量增加和疏水性增強，這些含較長脂肪酸側鏈的化合物在水溶液中趨于飽和，降低了其界面吸附率和向界面的傳輸速率，進而降低其發泡性[35]。因此，中等酰基鏈長的海藻糖脂肪酸二酯由因其均衡的親水親油性能而具有較好的起泡性。

如圖5B所示，質量濃度為0.2 g/100 mL時，對照物Span 20和S-1170在20 min內均無法穩定泡沫。海藻糖癸酸二酯、海藻糖月桂酸二酯和海藻糖肉豆蔻酸二酯均顯示出優于對照物的泡沫穩定性，其中海藻糖月桂酸二酯在80 min內的泡沫穩定性最佳（50%～70%）。總體而言，海藻糖脂肪酸二酯泡沫穩定性與其起泡性有關，特別是對于具有優異起泡性的海藻糖脂肪酸二酯，0.2 g/100 mL海藻糖癸酸二酯和海藻糖月桂酸二酯的起泡性分別為101.00%和142.67%，其泡沫穩定性也較強，分別為40%～60%和50%～70%。據報道[36]，低分子質量表面活性劑的起泡性和泡沫穩定性取決于多種因素共同作用，包括表面活性劑在空氣-水界面的吸附能力、界面流變特性和泡沫中捕獲氣體的擴散速率等。這些因素之間的相互作用仍需進一步研究。本實驗結果表明，中等酰基鏈長的海藻糖脂肪酸二酯具有較好的發泡性能，可作為發泡劑應用于食品工業中。

圖5 系列海藻糖脂肪酸二酯的起泡性（A）和泡沫穩定性（B）Fig.5 Foaming ability (A) and foam stability (B) of a series of trehalose fatty acid diesters

2.4 海藻糖脂肪酸二酯的熱穩定性

以市售蔗糖酯S-1170為對照，對系列海藻糖脂肪酸二酯進行熱重分析，結果如圖6所示。對照物S-1170質量在210 ℃時急劇下降，而此時海藻糖脂肪酸二酯質量未發生變化，表明系列海藻糖脂肪酸二酯較S-1170具有更好的熱穩定性。隨著溫度的升高，海藻糖肉豆蔻酸二酯質量下降最快，其他海藻糖脂肪酸二酯質量下降速率隨著碳鏈長度的增加而放緩，因此海藻糖脂肪酸二酯的脂肪酸碳鏈長度與其熱穩定性呈正相關。其中，海藻糖油酸二酯在264 ℃時質量才開始下降，當溫度達到350 ℃時剩余質量為60.58%，表現出最佳熱穩定性。因此，海藻糖脂肪酸二酯可作為食品乳化劑添加于需熱加工操作的食品中。

圖6 系列海藻糖脂肪酸二酯的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of a series of trehalose fatty acid diesters

2.5 海藻糖脂肪酸二酯的細胞毒性

由表1可知，較低濃度的阿霉素即可使細胞死亡。相較而言，僅較高濃度的海藻糖辛酸二酯和海藻糖癸酸二酯對鼠巨噬細胞RAW267.4、人肝癌細胞HepG2和宮頸癌細胞Hela有微弱毒性。除此之外，6種細胞系在海藻糖脂肪酸二酯濃度大于256.00 μmol/L時仍能存活。這些結果說明海藻糖脂肪酸二酯普遍具有安全低毒的優點。這與Kale等[10]報道的海藻糖油酸單酯對人肝癌HepG2細胞無細胞毒性的結果一致。因此，海藻糖脂肪酸二酯或可作為安全低毒的食品添加劑添加于食品中。

表1 海藻糖脂肪酸二酯的細胞毒性Table 1 Cytotoxicity assay of trehalose fatty acid diesters

3 結 論

通過在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，采用Novozym 435脂肪酶催化物質的量比為1∶4的海藻糖和系列脂肪酸乙烯酯在60 ℃下反應72 h，選擇性合成6,6’-O-海藻糖脂肪酸二酯，并通過NMR譜和MS分析確證其結構，其最高得率可達75%，這為海藻糖脂肪酸二酯的合成提供了綠色有效的新方法。通過計算和測定系列海藻糖脂肪酸二酯的HLB值、發泡性能和熱穩定性，發現其發泡性能隨碳鏈長度先增大后減小，其中海藻糖癸酸二酯和海藻糖月桂酸二酯具有極好的起泡性（分別為101.00%和142.67%）和泡沫穩定性（80 min內分別為40%～60%和50%～70%）。此外，系列海藻糖脂肪酸二酯均具有較好的熱穩定性，其熱穩定性隨碳鏈長度的增加而增強，其中海藻糖油酸二酯的熱穩定性最好，溫度達到264 ℃時質量開始下降，當溫度達到350 ℃時剩余質量為60.58%，這為開發具有優越的發泡性和熱穩定性的O/W型乳化劑提供了可能性。同時通過細胞毒性結果可以看出，系列海藻糖脂肪酸二酯具有安全低毒的優點。因此，海藻糖脂肪酸二酯作為一類新型糖酯，在食品工業中具有潛在的應用價值。而海藻糖脂肪酸二酯作為非離子表面活性劑的界面性質和乳化性質及其在食品中的應用需進一步研究。