白茶貢眉的香氣組成與關鍵呈香成分分析

劉 洋，劉雅芳，林 智，陳勤操,

（1.江西農業大學農學院，江西 南昌 330045；2.中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

白茶是我國傳統六大茶類之一，主要產區有福鼎、政和、松溪和建陽等縣，其中產于福鼎的白茶是我國白茶的典型代表[1]。白茶因具有滋味鮮甜、毫香顯著等風味品質特點[2]，以及良好的保健效果[3]而越來越受消費者的關注和喜愛。根據采摘標準和制茶原料的區別，可將白茶劃分為白毫銀針、白牡丹、壽眉和貢眉4種花色，在原料的選擇上貢眉與其他3 個花色白茶有很大區別，貢眉是以當地群體種茶樹的嫩稍為原料，經萎凋、干燥、揀剔等特定工藝過程制成的白茶產品，而其他3 個均是由福鼎大白茶、福鼎大毫等無性系茶樹的鮮葉制作而成[4]。

香氣是決定茶葉品質的重要因子之一，其對茶葉風味、等級評定以及大眾消費導向等都具有十分重要的作用。茶葉揮發性成分中存在少量關鍵呈香成分，對茶葉的香氣品質起到重要影響，具有重要的研究價值和研究意義[5]。直到2017年頒布白茶的新國標[4]，貢眉才正式作為白茶的品類之一被予以認定。目前在白茶香氣研究中多以白毫銀針、白牡丹及壽眉作為對象，這些花色白茶的香氣成分都以醇類、醛類、酮類等為主，但香氣成分的含量與手性構型存在明顯差異[6-8]。此外，不同花色白茶在壓餅陳化后香氣也存在差異，與白毫銀針相比，白牡丹和壽眉壓餅陳化后香氣品質更佳[9]。由此可見，不同原料制作的白茶香氣成分存在較大的差異。貢眉作為白茶種類中不可缺少的一類花色，有關其主要香氣組成及關鍵呈香物質的研究鮮見報道，致使無法科學闡述所有白茶種類的香氣特點。

全二維氣相色譜-飛行時間質譜（two-dimensional gas chromatography-time-of-flight-mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）技術是在傳統氣相色譜基礎上發展起來的一種新技術，具有靈敏度高、分辨率高、峰容量大、定性更準確和信息量大等優點，近年來已在茶葉香氣化學研究上得到了廣泛的應用，如綠茶[10-11]、紅茶[12]、黑茶[13]等。在眾多的香氣成分中，大部分香氣成分并沒有直接的呈香作用，只有少部分香氣成分起呈香作用。茶葉中關鍵呈香成分的分析方法一般有氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）、香氣活性值（odor activity value，OAV）、香氣化合物重組與消減實驗等。GC-OMS是通過嗅聞人員使用可變電阻器的移動記錄氣味隨時間變化強度的方法，已廣泛應用于鑒定茶葉中關鍵呈香成分研究中[14]。Brattoli等[15]在不同操作條件下評估不同氣味化合物嗅覺檢測方法，發現GC-O-MS相對于其他常規方法有改進。

本研究采用GC×GC-TOFMS技術分析貢眉的香氣組成，并結合GC-O-MS技術研究貢眉的關鍵呈香成分，以期為闡明貢眉的香氣品質化學提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選用的3 個貢眉樣品均收集于福建福鼎市，生產于2018年（表1）。為保證質量，3 個樣品根據GB/T 22291—2017《白茶》進行了鑒定和感官審評，均具有較好的香氣品質（表1）。在進行香氣分析之前，使用研磨機將茶樣品研磨成均勻的粉末，然后在－20 ℃保存備用。

表1 茶葉樣品信息及香氣評估Table 1 Producers and sensory evaluation of tea samples tested in this study

芳樟醇、芳樟醇氧化物I、壬醛、水楊酸甲酯、反-3-壬烯-1-醇、反-2-壬烯醛、異戊酸順-3-己烯酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮（均為分析純） 日本TCI公司；1-辛烯-3-醇、苯乙醛、萘（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；反,反-3,5-辛二烯-2-酮（分析純）美國AA Blocks公司；γ-壬內酯（分析純） 上海Adamas公司；正構烷烴（C8～C40） 北京百靈威公司。

1.2 儀器與設備

Tube Mill control研磨機 德國IKA公司；Pegasus 4D GC×GC-TOFMS儀 美國Leco公司；7890B GC儀、5977B MS儀 美國安捷倫公司；GC-O儀 德國Gerstel GmbH & Co公司；AB104-S電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團。

1.3 方法

1.3.1 揮發性化合物的提取與解吸附

參照前期已優化的方法進行[12,16]。萃取方法為頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME），萃取頭為碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS；85 μm，1 cm）。具體如下：首先將1.0 g茶粉放入20 mL玻璃小瓶中，加入6 mL沸騰去離子水；隨后立即用蓋密封，并放入60 ℃恒溫振蕩器中；待穩定3 min后，使用CAR/PDMS萃取頭吸附60 min；最后，將揮發性化合物250 ℃解吸5 min，以進行下一步分析。

1.3.2 揮發性化合物的GC×GC-TOFMS分析

參照前期已建立的GC×GC-TOFMS方法進行[12]。GC-MS系統為Pegasus4D GC×GC-TOFMS，一維柱色譜柱為Rxi-5MS MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm），二維柱色譜柱為Rxi-17Sil色譜柱（1.9 m×100 μm，0.10 μm）。GC條件：一維柱升溫程序：50 ℃保持2 min，然后以8.0 ℃/min速率均勻升至265 ℃，保持5 min；二維柱升溫程序：55 ℃保持2 min，以8.0 ℃/min速率均勻升至270 ℃，保持5 min；載氣為氦氣（99.999%），恒定流量為1.0 mL/min；傳輸線溫度250 ℃；分流比例為10∶1；調制解調時間為5.0 s。MS條件：電離電壓為1 590 V；質量掃描范圍m/z33～600；離子碰撞能量－70 eV；離子源溫度220 ℃；界面溫度270 ℃。

1.3.3 GC-O-MS分析

參照相關文獻的方法進行[12]。GC條件：氣相色譜柱為Rxi-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999%），恒定流量為1.6 mL/min；氣相色譜柱升溫程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min緩慢升至265 ℃，保持5 min；采用不分流進樣模式。MS條件：電子電離源；電離電壓1 353 V；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；使用全掃描模式，質量掃描范圍m/z50～550；離子碰撞能量－70 eV。嗅覺條件：MS檢測器和嗅覺檢測端口之間的分配比為1∶1；傳輸線和嗅聞口的溫度分別為260 ℃和230 ℃；氮氣（99.99%）作為輔助氣體，其流速為50 mL/min的恒定流量施加。為防止評估者的鼻黏膜干燥，GC嗅聞口有提供水分。

嗅聞分析小組由5 名（2 名男性和3 名女性）具有豐富審評經驗的審評員組成，經過了至少90 h的培訓[12]，并且還接受了2 個質量控制茶樣的培訓。香氣強度定義為1～4：1弱、2中等、3強烈、4極強。如果被至少3 名成員嗅聞到或2 名成員嗅聞到但香氣強度比較強烈（不小于3），且香氣描述類似，則認為該香氣成分為關鍵呈香成分，并通過MS，保留指數（retention index，RI）和標準品進行結構鑒定。

1.4 數據處理

使用LECO Chroma TOF軟件處理GC×GC-TOFMS數據：一維峰寬和二維峰寬分別為25.0 s和0.1 s。最小RSN為50，最小相似匹配為750（最大1 000）；使用Statistical comparison功能完成峰匹配，一維保留時間和二維保留時間偏差分別設置為0.2 min和0.2 s；使用正構烷烴（C8～C40）計算揮發性化合物的一維RI，如果本次實驗RI和報道RI差異大于20，則刪除該化合物[17]。

揮發性化合物的相對含量由單個揮發性化合物的峰面積（A）與單個樣品中所有鑒定得到的揮發性化合物的總峰面積（Atotal）比值計算。

2 結果與分析

2.1 貢眉香氣成分的鑒定

通過對Mainlib、Replib及NIST_ri譜庫的自動檢索，在貢眉茶樣中檢測到了近千個揮發性物質，通過MS相似性匹配、RI比對以及標準品驗證，總計鑒定得到236種可靠的揮發性成分，包括數量最多的醛類45種、酮類39種、酯類29種、烯烴類28種、醇類27種、芳香烴類22種、烷烴類17種、氧雜環類15種、氮雜環類8種、酸類3種、其他物質2種及硫化物1種（表2）。

表2 貢眉揮發性成分組成及其相對含量Table 2 Volatile components and their relative contents in Gongmei white tea samples

續表2

續表2

續表2

續表2

2.2 貢眉香氣成分組成分析

如表3所示，醛類化合物相對含量最高（38.46%），醇類（25.58%）次之，醛類和醇類化合物的總相對含量大于60%。有研究表明，茶鮮葉中含有豐富的醇和醛類香氣物質，并且在白茶萎凋過程中會進一步大量增加[16,18]，這可能是貢眉中醛和醇含量高的原因。酮類、酯類和烯烴類物質的數量雖然都多于25種，但是相對含量不高，分別為7.61%、4.56%和3.36%。芳香烴類和烷烴類物質相對含量中等，分別為3.31%、5.59%。在此研究中，氧雜環類化合物，尤其是呋喃衍生物的相對含量相對較高，達到了7.02%，硫化物相對含量亦達到了3.67%，與現有的研究結果相差較大[7,19]。酸類（0.53%）、氮雜環類（0.30%）和其他（0.02%）化合物在貢眉中的相對含量極低。

表3 貢眉中不同種類揮發性化合物的相對含量Table 3 Contents of different classes of volatile compounds in Gongmei white tea

就單個香氣成分而言，相對含量較高的成分（≥10‰）有18種，包括醛類6種、醇類5種及其他化合物7種，分別為苯甲醛（147.27‰）、反-2-己烯醛（90.14‰）、芳樟醇（79.80‰）、苯乙醇（50.76‰）、2-戊烷基呋喃（46.23‰）、香葉醇（39.06‰）、水楊酸甲酯（37.80‰）、二甲基硫醚（36.69‰）、正癸烷（31.68‰）、正己醛（29.39‰）、苯乙醛（25.06‰）、苯甲醇（22.15‰）、順-3-己烯-1-醇（19.30‰）、2-甲基正丁醛（17.47‰）、2-乙基呋喃（15.79‰）、壬醛（13.25‰）、反,反-3,5-辛二烯-2-酮（9.17‰）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（10.92‰）（表2）。研究表明這些化合物主要表現出天然的清香、花香、果香或甜香[20-21]，這可能是貢眉呈現純正、清鮮帶花香的原因。前期研究顯示白茶中香氣含量最高是芳樟醇[7]或己醛[19]，而本研究發現貢眉香氣相對含量最高的是苯甲醛（147.27‰），這可能與茶葉的原料及檢測方法不同有關。

2.3 貢眉香氣成分的GC-O-MS分析

茶葉中香氣成分眾多，但僅有很少一部分起主要作用，具有這樣性質的揮發性組分稱為關鍵呈香成分或香氣活性成分[22]。因此，揮發性成分含量的高低并不能說明其對香氣的貢獻度大小，關鍵呈香成分還需要結合GCO-MS結果做進一步判斷。

如表4所示，本次研究檢測到26種關鍵香氣活性化合物，其中鑒定出了21種，包括醇類9種、醛類5種、酮類4種、酯類2種和芳香烴類1種；此外，可能歸因于相應揮發物的濃度極低，以及當前的HS-SPME-GC-MS方法不完善，有5種香氣活性化合物沒有被鑒定出來，其依次被命名為未知1～5。根據這些香氣活性物質的氣味特征，上述26種化合物可分為如下3種氣味類型：A類主要表現出類似草本的氣味，如清香、青草香或清爽香味；B類主要表現出令人愉悅的氣味，如花香、果香、奶香或甜香；C類中的氣味主要表現出令人不愉悅的氣味，如臭味、辛味或藥劑味。

表4 貢眉中關鍵呈香成分的香氣特征及強度Table 4 Aroma characteristics and intensity of key aroma compounds in Gongmei white tea samples

A類香氣物質包括正己醛、順-3-壬烯-1-醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、反,反-3,5-辛二烯-2-酮、反-3-壬烯-1-醇、反-2-壬烯醛、水楊酸甲酯及異戊酸順-3-己烯酯，這些香氣物質主要來源于脂肪酸降解[16,20]。其中，反-2-壬烯醛是一種重要的呈香物質，有助于綠茶[23-24]和抹茶[25]香氣品質的形成；己醛也是綠茶[10]和烏龍茶[26]香氣品質形成的重要貢獻者。值得注意的是，通常A類香氣物質是具有雙重氣味特征，在低濃度下會散發出令人愉悅的清香和鮮爽氣味，而在高濃度下會呈現令人不快的草味或青臭味[27-28]。因此，適量的A類香氣成分將使貢眉具有令人愉悅的清香或清鮮香味，而高比例的A類香氣成分則可能使貢眉具有青氣。

B類香氣物質包括苯甲醇、苯乙醛、芳樟醇氧化物I、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、香葉醇、γ-壬內酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮以及未知化合物1、2、4、5，這些物質主要由揮發性萜類、氨基酸衍生的揮發性物質和類胡蘿卜素衍生的揮發性物質組成[16,20]。不同于A類香氣成分具有雙重氣味特性，B類香氣無論低濃度或高濃度都呈現出花香、果香、甜味或其他令人愉悅的氣味。芳樟醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、芳樟醇氧化物I和苯乙醇是紅茶[12,21,29]和烏龍茶[26]的關鍵香氣活性化合物。Feng Zhihui等[30]發現β-紫羅蘭酮是白茶香氣成分中香氣影響因子最高的成分，這與本實驗中β-紫羅蘭酮的香氣強度為3這一結果相似。苯乙醇的香氣強度最高，達到了4.0，據報道苯乙醇具有芳香氣味且香氣閾值為0.62 mg/kg，閾值較低[31]，而其含量則相對較高（50.76‰），這可能是本研究中苯乙醇有較高香氣強度的原因。

C類香氣物質包括萘、5-乙基-6-甲基-3-庚烯-2-酮和未知3，并呈現中高等強度（2～3）的難聞味道，如辛味、青臭味。萘是茶葉揮發性物質中常見的不愉悅氣味，在綠茶[11]中呈現泥土氣味，在宜紅茶[29]中呈現柏油、樟腦味，在青磚茶[32]中表現為辛辣、陳腐等氣味。

如圖1所示，B類香氣物質總強度最高，A類次之，C類最低。B類香氣的總強度（40.2）高于A類（23.5），A類香氣的總強度又高于C類（6.7）。B類香氣主要呈現愉悅的花香、果香或甜香等氣味，A類香氣主要呈現清香、清鮮或青氣等氣味，因此，高比例的B類香氣（57.1%）和適中比例的A類香氣（33.4%）是貢眉香氣呈現清鮮帶花香的基礎。

圖1 貢眉中不同類別香氣活性成分的總強度示意圖Fig.1 Total intensities of different classes of aroma-active compounds in Gongmei white tea

2.4 GC×GC-TOFMS和GC-O-MS結果聯合分析

如圖2所示，鑒定出的21種芳香化合物在其相對含量和香氣強度上表現出較大差異。在相對含量和香氣強度上表現都很突出的化合物有芳樟醇和苯乙醇，并且都呈現出花果香類型的氣味，這與之前研究報道的芳樟醇、苯乙醇等是白茶主要的香氣物質相符[6-7]。值得注意的是，有一些香氣成分的相對含量低，但香氣強度較高，主要有1-庚醇、反-3-壬烯-1-醇、反-2-壬烯醛、異戊酸順-3-己烯酯、γ-壬內酯、α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮，這應該歸因于它們的呈香閾值比較低。如β-紫羅蘭酮的香氣閾值極低，僅為0.007 μg/kg，是橘紅茶中花香馥郁的特征物質[29]，這與本實驗檢測結果相符，因此推測β-紫羅蘭酮對貢眉花香的貢獻較大；肖作兵等[33]在對工夫紅茶香氣進行定性定量分析時發現γ-壬內酯（閾值0.025 μg/kg）的OAV為9.33，是工夫紅茶花香的關鍵香氣成分。此外，正己醛、苯甲醇、苯乙醛、壬醛、水楊酸甲酯等其他大部分香氣相對含量較高且香氣強度亦較高，這些香氣成分也在不同程度上對貢眉香氣的形成作出了貢獻。

圖2 貢眉中關鍵呈香成分的相對含量和香氣強度比較圖Fig.2 Comparison of relative contents and aroma intensities of key aroma-active compounds in Gongmei white tea

從GC×GC-TOFMS結果看，醛類和醇類物質是貢眉的主要香氣成分（表2和表3）；從GC-O-MS結果看，醇類和醛類亦是貢眉的主要呈香成分（表4），因此，高比例的醇類和醛類香氣成分是貢眉香氣品質形成的基礎。

3 結 論

本研究采用GC×GC-TOFMS技術詳細研究了貢眉中的香氣成分組成，鑒定得到236種香氣成分，其中醛類（38.46%）和醇類（25.58%）是貢眉中最豐富的香氣成分；苯甲醛、反-2-己烯醛、芳樟醇、苯乙醇、2-戊烷基呋喃、香葉醇等是貢眉中含量相對較高的揮發性物質。進一步采用GC-O-MS技術檢測到26種關鍵呈香物質，其中鑒定出21種，主要為醇類和醛類香氣；這些關鍵呈香成分主要呈現清香、清鮮、花香、果香或甜香等令人愉悅的天然香味，其中苯乙醇、芳樟醇、反-2-壬烯醛、壬醛和β-紫羅蘭酮等化合物的香氣強度較高。GC×GCTOFMS和GC-O-MS結果聯合分析，高比例的醇類和醛類香氣成分是貢眉呈現清鮮香氣特征的基礎。本研究結果將加深對白茶香氣品質化學的認識。