單一及混合益生菌發酵獼猴桃果汁的香氣成分分析

張 璐，梁 錦，黃天姿，王 丹，李瑞娟，楊淑霞，羅安偉

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃含有多種對人體有益的營養成分，具有很高的營養和保健價值，素有“VC之王”的美稱，深受消費者喜愛。獼猴桃采收后極易后熟軟化，常溫下貯藏期短，且加工率低，產品形式單一，加工品主要有果干、果醬、果汁飲料和果酒，在干燥、熬煮及乙醇發酵等加工過程中營養成分及香氣損失嚴重，產品香氣不足、典型性不強。因此，獼猴桃加工亟需尋找新的突破口，以提高產品品質與附加值。益生菌可以幫助消化系統微生態失衡人群建立正常的菌群，益生菌發酵可以改善獼猴桃汁的香氣和風味特征，提高營養成分吸收利用率，改善腸道微生態環境，清理腸道有毒物質[1]。近年來，益生菌發酵果蔬汁越來越受到消費者的青睞，鄭欣等[2]利用保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌混合發酵荔枝汁，王德純等[3]采用開菲爾菌種發酵蘋果汁，Ellendersen等[4]利用干酪乳桿菌發酵蘋果汁，以上研究均表明益生菌發酵具有提升果蔬汁風味、增加營養及功能成分含量等積極效果。目前，發酵果蔬汁中以植物乳桿菌和副干酪乳桿菌等益生菌的適應性較好，發酵產品的品質好[5]。

目前大部分研究側重于單一發酵或者混合益生菌發酵果蔬汁，并沒有深入比較單一益生菌發酵和混合益生菌發酵果蔬汁之間的差異性及混合益生菌發酵果蔬汁的優勢。并鮮有將香氣成分與香氣值結合分析的文章，本研究參考香氣閾值結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結果，更加準確直觀地分析比較單一和混合益生菌發酵獼猴桃果汁之間的香氣成分差異。

本研究以陜西省主栽品種徐香獼猴桃為原料，采用植物乳桿菌115、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌115-副干酪乳桿菌（1∶1）復配的3種益生菌作為發酵劑，發酵制得獼猴桃益生菌果汁。以原果汁為對照，與3 組發酵獼猴桃果汁的香氣成分種類及含量進行比較分析，探究單一菌種及混合菌種發酵獼猴桃果汁香氣的差異，旨在為開發營養健康、香氣典型的獼猴桃益生菌發酵果汁提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

徐香獼猴桃采自陜西省眉縣（東經107.76°，北緯34.29°），采收時果實可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）為6.5%～7.0%，果實大小均勻、果肉飽滿、無病蟲害。

氫氧化鈉、蒽酮、蔗糖標準液、抗壞血酸標品、環己酮、氯化鈉、磷酸緩沖液（均為化學純或分析純）天津市天力化學試劑有限公司；果膠酶（60 U/mg）、沒食子酸、蘆丁 美國Sigma公司。

植物乳桿菌115（Lactobacillus plantarum115）、副干酪乳桿菌（L.paracasei） 美國杜邦公司。

GCMS-QP2010 Ultra GC-MS聯用儀 日本島津公司；手動固相微萃取裝置（附帶50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭） 美國Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃發酵果汁的制備工藝流程

獼猴桃→清洗→破碎→酶解→榨汁→過濾→成分調整→巴氏滅菌→冷卻→接種→發酵→灌裝→獼猴桃益生菌果汁

1.2.2 操作要點

1）果實在室溫下自然后熟（SSC為（15.0±1.0）%、果肉硬度1.0 kg/cm2左右）。自來水清洗、瀝水后打漿，果漿中加入0.04 g/kg果膠酶，40 ℃酶解2 h。2）用200 目尼龍紗布過濾酶解果漿得到獼猴桃果汁，加蔗糖調節SSC為（18.0±0.5）%，于75 ℃殺菌10 min。3）果汁冷卻后分為4 份，3 份在無菌操作臺上按照108CFU/mL接種量分別加入植物乳桿菌115、副干酪乳桿菌及植物乳桿菌115-副干酪乳桿菌（1∶1）復配的菌懸液，均在36 ℃發酵24 h，得獼猴桃益生菌發酵果汁。

1.2.3 指標測定

SSC測定：使用數顯手持折射儀；總酸測定：參照曹建康等[6]的方法；多酚測定：采用Folin-Ciocalteu法，以沒食子酸為標準物質測定多酚含量[7]；總黃酮測定：采用AlCl3顯色法，以蘆丁為標準物質測定類黃酮的含量[8]。

1.2.4 獼猴桃汁活菌數和感官評定的測定

活菌數：傾注平板法。

感官評定：15 名受過訓練的老師和學生組成感官評定小組，從組織狀態、色澤、香氣、口感、滋味5 個方面對各組獼猴桃果汁進行評分，評分標準如表1所示[9]。

表1 獼猴桃益生菌果汁感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of probiotic fermented kiwifruit juice

1.2.5 發酵果汁生長曲線OD600nm值及產酸能力的測定

根據乳酸菌生長動力學的研究可知，由于菌液在OD600nm值和其顯微鏡計數之間存在相關關系，因此可通過測定OD600nm值評定發酵液中的活菌數[10]。OD600nm值直接用分光光度計進行測定，以原果汁為參比溶液，每隔4 h取樣進行測定，重復3 次，取平均值。同時每4 h測定溶液的總酸。

1.2.6 香氣成分的分析

參照馬婷等[11]的方法，采用頂空固相微萃取法進行香氣成分的富集。取5.0 mL獼猴桃果汁樣品于20.0 mL進樣瓶中，分別加入1.0 g氯化鈉和0.4 mg/mL環己酮內標溶液，上機測定。進樣瓶先在45 ℃平衡30 min，再用老化處理過的萃取頭插入進樣瓶中，頂空吸附30 min，然后進行解吸。

1.2.7 GC-MS條件

色譜條件：初溫40 ℃，保持3 min，以7 ℃/min上升到200 ℃，再以10 ℃/min上升到230 ℃，保持3 min。色譜柱為DB-LMS石英毛細柱（60 m×0.25 mm，0.25 mm），載氣（He）流速1.0 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，放射電流150 μA，傳輸線溫度230 ℃，質量掃描范圍35～450 u。

1.2.8 香氣分析方法

由GC-MS中NIST 14質譜數據庫、匹配度和保留時間與標準譜圖對照，從而對各個物質進行檢索。選擇相似度指數大于80的物質作為有效的香氣成分。每次檢測時加入相同量的內標物環己酮進行定量分析，同時結合已有的報道結果對其進行定性分析，根據面積歸一化法對香氣成分對應峰進行定量。

1.2.9 定性與定量

定性：香氣成分利用質譜全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據色譜保留時間和質譜信息、NIST標準譜庫比對結果以及參考相關文獻相結合的方法進行定性分析。

定量：采用內標法，按式（1）計算各發酵獼猴桃汁中香氣物質的質量濃度：

1.3 數據處理

數據采用Origin 8.0作圖，采用Excel 2010、SPSS 19.0軟件對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃果汁理化指標測定結果

如表2所示，單一菌株發酵和混合菌株發酵與原果汁相比，總酚、總酸含量和SSC都有顯著升高（P＜0.05），植物乳桿菌115、副干酪乳桿菌和混合菌種的總酚分別是原果汁的1.03、1.08、1.09 倍；總酸含量分別是原果汁的1.63、1.70、1.79 倍；SSC分別是原果汁的1.03、1.07、1.13 倍；副干酪乳桿菌和混合菌種的總黃酮含量分別是原果汁的1.06、1.07 倍。除植物乳桿菌115發酵汁中的總黃酮外，混合菌株發酵后的營養指標顯著高于（P＜0.05）單一菌株，這是由于單一菌株發酵產生營養物質和功能物質的能力較弱，而混合菌株產生協同作用使發酵產物更多，發酵效率高。獼猴桃汁益生菌發酵時混合菌株發酵優于單一菌株發酵。

表2 各樣品組營養指標對比Table 2 Comparison of nutritional components of fresh and fermented kiwifruit juices

2.2 獼猴桃果汁單一和混合菌株發酵過程中OD600 nm值的變化

單一和混合菌株發酵獼猴桃果汁過程中每隔4 h取樣，測定3 組果汁OD600nm值的變化，如圖1所示。隨著發酵時間的延長，3 組果汁樣品中的OD600nm值均呈現上升趨勢，這與李冬華[12]研究的植物乳桿菌在圣女果汁中的生長趨勢一致。發酵前8 h，各發酵組的OD600nm值上升較為緩慢，這是由于菌株在獼猴桃果汁中有一定的適應過程，處于繁殖初期，發酵產物較少。在12～20 h時，OD600nm值呈對數增加，說明此時菌株已經適應新的營養條件，利用果汁中的糖類等碳源大量增值，并產生氨基酸、短鏈脂肪酸等優良產物。在20 h之后，OD600nm值趨于平緩，說明已經達到了發酵終點。在12 h之后，混合菌株的生長曲線明顯高于其他兩株單一菌株的生長曲線，且達到發酵終點時的OD600nm值高于其他兩組，說明混合菌株發酵的獼猴桃果汁中產生了更多的有益物質。且經過感官評定，發酵24 h的獼猴桃汁風味最佳，因此，后續實驗中均以24 h為發酵時間。

圖1 益生菌在獼猴桃果汁中的生長曲線Fig.1 Growth curves of probiotics inoculated in kiwifruit juice

2.3 單一和混合菌株發酵獼猴桃果汁中可滴定酸含量的變化

單一和混合菌株發酵獼猴桃果汁過程中每隔4 h取樣，測定3 組果汁中可滴定酸含量的變化，徐香獼猴桃原汁可滴定酸質量分數為0.70%。由圖2可知，隨著發酵時間的延長，可滴定酸含量逐漸上升，在0～8 h之間，單一菌株和混合菌株的產酸能力相近，在8 h之后，混合菌株的產酸能力明顯高于單一菌株，發酵結束時，混合菌株的產酸量達到1.28%，產酸量為單一菌株的1.1 倍，而兩株單一菌株發酵的產酸能力相近，發酵結束后的產酸量也接近。在相同的發酵時間，混合菌株產酸能力高于單一菌株。

圖2 益生菌在獼猴桃果汁中的產酸情況Fig.2 Acid production by probiotics inoculated in kiwifruit juice

2.4 單一和混合菌株發酵獼猴桃果汁感官評分

如表3所示，混合菌株發酵結束后測得的活菌數高于單一菌株發酵，感官評分也高于單一菌株組。如圖3所示，單一菌株發酵和混合菌株發酵后果汁的色澤和組織狀態差別不大，但香氣、滋味混合菌株發酵顯著高于單一菌株發酵（P＜0.05）。綜上可知，混合菌株發酵不僅可以提升果汁中的活菌數，同時可以改善單一菌株發酵果汁后的口感和香氣，因此混合菌株發酵果汁優于單一菌株發酵。

表3 各樣品組發酵結果Table 3 Viable bacterial counts and sensory scores of fermented kiwifruit juices

圖3 益生菌發酵獼猴桃果汁感官評分雷達圖Fig.3 Radar chart of sensory scores of probiotic fermented kiwifruit juices

2.5 獼猴桃發酵果汁的香氣成分分析

2.5.1 原果汁和發酵果汁的香氣成分

采用GC-MS技術在4 組果汁樣品中共鑒定出74種香氣成分（表4），這些成分主要是包括醇類17種、酯類19種、醛類12種、酸類4種、烷烯烴類8種、酮類8種、其他類6種。其中發酵果汁和原果汁中共同的組分有醇類7種、酯類4種、酸類1種、醛類3種、酮類1種、其他類1種。混合菌種和單一菌種發酵果汁中共同的組分有醇類9種、酯類5種、酸類1種、醛類4種、酮類4種、烯烴類1種、其他類2種。

表4 原果汁和發酵果汁的香氣成分Table 4 Analysis of aroma components in fresh and fermented kiwifruit juice

續表4

2.5.2 原果汁和發酵果汁中的醛類香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，分別檢測出醛類物質6、5、5、8種，含量占香氣物質總量的28.61%、11.58%、9.58%、10.97%。乙醛是乳酸菌進行糖代謝的中間產物，在各發酵組的樣品中均檢測出，混合菌種產生的乙醛高于單一菌種[13-14]。正己醛在原果汁中含量顯著高于發酵組（P＜0.05），占香氣成分總量的24.75%，可以推斷正己醛是徐香獼猴桃原果汁的特征風味物質。混合菌株發酵新產生了正庚醛、壬醛、癸醛、反-2-十二烯醛4種醛類物質，占香氣總量的1.28%。正庚醛和癸醛具有水果的香味，壬醛具有濃郁的玫瑰和甜橙氣味，可以賦予果汁良好的花香和果香香氣，香味更加馥郁。因此，這4種醛類物質是混合菌株發酵獼猴桃果汁產生的特有香氣。

2.5.3 原果汁和發酵果汁中的醇類香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，分別檢測出醇類物質11、12、11、12種，含量占香氣物質總量的43.16%、60.35%、53.88%、53.33%。單一菌株和混合菌株發酵比原果汁多產生了6種新的醇類物質；在醇類香氣成分中，原果汁中含量較高的物質分別為反式-2-己烯-1-醇、正己醇、桉葉油醇，含量分別占香氣物質總量的10.53%、17.26%、7.23%；植物乳桿菌115發酵果汁中含量最高的醇類物質分別為正己醇、桉葉油醇、異戊醇，含量分別占香氣物質總量的41.45%、5.38%、4.73%；副干酪乳桿菌發酵果汁中含量較高的醇類物質分別為正己醇、正庚醇、乙醇，含量分別占香氣物質總量的44.50%、1.20%、1.55%；混合菌種發酵果汁中含量較高的醇類物質分別為正己醇、正庚醇、反式-2-己烯-1-醇，含量分別占香氣物質總量的31.05%、5.97%、6.31%。3 組發酵汁中共有的物質是正己醇和正庚醇，雖然在原果汁中也含有正己醇，但是發酵組的含量顯著高于原果汁（P＜0.05）；正己醇具有濃郁的水果香氣，隨著含量的升高，果香更濃郁、典型[15]。正庚醇具有油脂氣息和辛辣香氣，近似柑橘香氣，天然品存在于丁香、風信子等精油中。混合菌種較單一菌種多產生了兩種新的醇類物質正丁醇、4-萜烯醇，含量占香氣總量的0.064%和0.30%。正丁醇具有香蕉、奶油的特殊香味[16]；4-萜烯醇具有淡的迷迭香味。因此，這2種醇類物質是混合菌種發酵獼猴桃汁產生的特征香氣物質，賦予了獼猴桃發酵汁醇厚的風味和獨特復雜的香氣。

2.5.4 原果汁和發酵果汁中的酯類香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，分別檢測出酯類物質10、8、11、14種，含量占香氣物質總量的22.44%、16.01%、23.70%、24.21%。單一發酵和混合發酵比原果汁多產生了9種新的酯類物質，在酯類香氣成分中，原果汁中含量較高的物質分別為丁酸乙酯、丁酸甲酯，含量分別占香氣物質總量的11.37%、5.20%；混合菌株發酵果汁中含量較高的酯類物質分別為丁酸乙酯、苯甲酸甲酯、丁酸甲酯、乙酸己酯，含量分別占香氣物質總量的7.81%、6.77%、4.04%。植物乳桿菌115發酵比原果汁多產生了乙酸己酯、乙酸戊酯、鄰苯二甲酸二異丁酯；副干酪乳桿菌發酵比原果汁多產生了乙酸己酯、乙酸戊酯、乙酸乙酯、丁酸己酯；兩株單一菌株發酵所產生的香氣成分并不是完全一樣，這是由于菌株品種的原因，每種益生菌菌株都會產生自己的特征香氣，從而區分各個菌株，由此可以得出植物乳桿菌115發酵所特有的香氣成分為鄰苯二甲酸二異丁酯，副干酪乳桿菌發酵所特有的香氣成分是乙酸乙酯和丁酸己酯。而混合菌株較單一菌株多產生的4種新的酯類物質分別為(E)-乙酸-2-己烯-1-醇酯、2-異丁基乙酰乙酸乙酯、己酸烯丙酯、癸酸甲酯，占香氣總量的1.92%；乙酸己酯具有青香和果香，且具有蘋果和梨的味道[17]，研究表明丁酸己酯盡管含量低但對果實風味影響很大[18]；(E)-乙酸-2-己烯-1-醇酯具有良好的糖果清香，是發酵所特有的香氣成分；己酸烯丙酯是己酸和丙醛經過一系列復雜的發酵反應所得到的香氣成分，具有鳳梨的氣味[19]；這兩種酯類物質也是混合菌株發酵獼猴桃汁的特征香氣。在水果和果汁中，酯類物質的種類和含量是影響其品質和香氣的主要因素。由表3可知，混合菌株發酵產生的酯類物質種類和含量均高于單一菌株，賦予了果汁更加豐富的口感、香氣與滋味。

2.5.5 原果汁和發酵果汁中的烷烯烴類香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，分別檢測出烷烯烴類物質2、3、2、5種，含量占香氣物質總量的2.44%、2.61%、0.96%、1.18%。單一發酵和混合發酵較原果汁多產生了6種新的烷烯烴類物質，在烷烯烴類香氣成分中，原果汁中僅含有十二烷和蘇合香烯；植物乳桿菌115和副干酪乳桿菌發酵較原果汁多產生了2-蒎烯、2,4-二甲基苯乙烯；而混合菌種較單一菌種多產生了萜品油烯、2-莰烯、萜品烯，萜品烯具有柑橘和檸檬香氣[20-21]，萜品油烯具有獨特的香料味道，據研究表明萜品油烯常用于添加飲料和果汁里的良好香料，2-蒎烯天然存在于許多精油中，如薰衣草、橙花、檸檬等，同時可以作為合成樟腦的原料，2-莰烯是由2-蒎烯在酸性作用下異構化而成，因此是發酵后產生的特征萜類物質，是混合發酵所產生的特征香氣物質。

2.5.6 原果汁和發酵果汁中的酮類香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，分別檢測出酮類物質2、6、4、8種，含量占香氣物質總量的1.16%、6.64%、7.48%、7.35%。單一菌株和混合菌株發酵比原果汁多產生了6種新的酮類物質。3 組發酵果汁樣品共有的酮類揮發性物質分別為2-甲基-3-戊酮、3-辛酮、香葉基丙酮。3-辛酮具有酮香、青香及淡淡的薰衣草香，并有蘑菇、干酪、水果的清香[22]，是3-辛醇經發酵所產生的特有揮發性物質；香葉基丙酮曾在芒果酒和葡萄酒中有過報道，是一種帶有甜味、青草味和水果香味的揮發性香氣成分[23-25]。混合菌株比單一菌株發酵多產生了2種新的酮類物質，分別為大馬士酮、甲基異丙烯基甲酮，大馬士酮具有強烈的玫瑰香味[26]，甲基異丙烯基甲酮具有香蕉、梨的水果香氣，是合成芳樟醇的中間物質[27-28]。這兩類物質賦予混合菌株發酵汁獨特的香氣，較單一菌株發酵的果汁，有更為濃郁的香氣和滋味。

2.5.7 原果汁和發酵果汁中的酸類香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，均檢測出酸類物質2種，含量占香氣物質總量的0.44%、1.31%、1.18%、0.76%。其中混合菌株種發酵比單一菌株發酵多產生了壬酸，壬酸具有漿果香味，是辛烯與發酵產生的酸反應所得的特有揮發性物質，是混合菌株發酵的特征香氣物質。

2.5.8 原果汁和發酵果汁中的其他香氣物質

在KF、ZKF、FKF、MKF 4 組果汁中，分別檢測出其他類（胺類、酚類）物質3、3、4、3種，含量占香氣物質總量的1.74%、1.50%、3.22%、2.21%。除了常見的醇類、酯類、醛酮類香氣成分，獼猴桃果汁在發酵后會產生一些其他類的揮發性物質，有胺類、酚類等，這些物質的含量都很低，但是其具有的特殊香味也會為發酵果汁做出貢獻。且混合菌株發酵汁中其他類物質含量明顯高于單一菌株發酵汁。

2.5.9 原果汁和發酵果汁中的香氣值

香氣的香勢可以根據其閾值的高低判斷，香氣閾值是指能夠辨別出香氣或者味道的最低濃度，閾值越低，香氣的香勢越強；香氣值是揮發性物質的含量與該種物質的香氣閾值的比值。香氣值越大則對總體香氣的貢獻越大，香氣值大于1的是對發酵獼猴桃果汁香味起主要作用的芳香成分，稱為特征香氣成分[15,29]。

根據已有報道的香氣閾值[15,29]分析各揮發性物質的香氣值見表5。4 組果汁的香氣值存在一定的差異，在醛類成分中，正己醛和反式-2-己烯醛香氣值遠大于1，可以作為原果汁的特征香氣成分[30]；在混合菌株發酵果汁中，正己醛、壬醛、癸醛香氣值遠大于1，可以作為其特征香氣成分。在醇類成分中，正庚醇可以作為發酵果汁組的特征香氣成分，葉醇在4 組樣品中均被檢測出，但是只有混合菌株發酵果汁的香氣值大于1，因此葉醇可以作為其特征香氣成分；異戊醇只有在植物乳桿菌115發酵果汁中香氣值大于1，可以作為植物乳桿菌115發酵產生的特征香氣成分。在酮類物質中，3-辛酮在3 組發酵果汁中均被檢測出，香氣值均大于1，且混合菌株發酵汁的香氣值高于單一菌株發酵汁的香氣值，3-辛酮也是發酵獼猴桃汁的特征揮發性物質。甲基庚烯酮只在副干酪乳桿菌發酵和混合菌株發酵果汁中的香氣值大于1，可以作為其特征香氣成分。

表5 原果汁和發酵果汁的主要揮發性物質的香氣值Table 5 Aroma values of fresh and fermented kiwifruit juices

3 結 論

在益生菌發酵獼猴桃果汁的過程中，混合菌株的OD600nm值明顯高于單一菌株，且產酸能力高于單一菌株發酵。OD600nm值大則增殖快，產生的有益風味物質多，在相同時間內混合菌種發酵果汁優于單一菌種發酵果汁。

采用GC-MS分析原果汁和發酵果汁的揮發性成分，在4 組樣品中分別檢測出36、39、39、53種香氣物質，含量分別為15.14、18.63、17.66、32.11 mg/kg。混合菌株發酵比單一菌株發酵多產生了14種香氣物質，且含量增加了13.48～14.45 mg/kg。通過對各揮發性成分的香氣閾值與香氣值分析，各發酵獼猴桃果汁中的特征香氣成分主要有正庚醇、乙酸己酯、3-辛酮、2-蒎烯等，較單一菌株發酵而言，混合菌株發酵獼猴桃果汁產生了癸醛、壬醛、正庚醛等特征香氣，這些香氣化合物可以賦予獼猴桃果汁更濃郁的青香、花香和果香，風味與滋味得到改善。

綜上所述，單一益生菌發酵和混合益生菌發酵在一定程度上賦予了獼猴桃果汁更豐富的口感，且混合菌株比單一菌株發酵產生了更多的營養物質和功能物質，多酚、黃酮、固形物含量及酸類物質、香氣物質含量顯著增加，果汁風味、香氣更濃郁、典型。研究結果為開發益生菌發酵獼猴桃汁提供了理論依據。