不同頂空進樣技術結合多同位素內標法對香氣物質定量分析的選擇性差異

馬麗鑫，鄭 旭，黃旭輝，孫浩媛，徐獻兵，董秀萍，秦 磊

（大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

香氣是評價食品品質的重要指標之一[1]。食品香氣的形成建立在復雜的物質基礎之上[2]，如何獲取準確的食品香氣信息一直是研究熱點。目前，食品香氣物質的定量萃取方式主要分為溶劑萃取和頂空萃取。其中，溶劑萃取方式主要有液液微萃[3]、同時蒸餾萃取[4]、溶劑輔助蒸餾萃取[5]等。雖然溶劑萃取能夠獲得更多的揮發性化合物，但是易產生溶劑效應引入新的雜質。同時，溶劑萃取通常需要對食品結構破壞，而這些物理化學破壞同樣會導致香氣分析與食品原有狀態的香氣發生偏差[6]。頂空萃取方式雖然局限于萃取頭或者收集方式的能力導致獲得的香氣物質信息相對液體萃取方式較少，但其萃取過程中無需對食品的結構進行破壞，更好地體現了食品正常狀態下散發出的香氣信息。頂空進樣技術在不同產地紅茶香氣品質對比[7]、不同品種芒果香氣差異比較[8]以及食用菌體不同部位揮發性成分分析[9]等方面均有應用。因此，分析不同頂空萃取方式的差異，綜合不同頂空進樣方式對香氣物質定性定量的能力，對食品中香氣物質的分析具有重要意義。

頂空進樣方式主要分為靜態頂空萃取和動態頂空萃取。靜態頂空是分析半揮發性和揮發性樣品常見的一種進樣方式，是將樣品置于密閉容器中，經過一定溫度和時間后達到氣液平衡，取氣相部分進樣，又稱一次氣相進樣，主要包括直接靜態頂空進樣和頂空固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）。動態頂空為經過連續氣相萃取或多次萃取將樣品中的揮發性物質全部萃取出來，通過吸附裝置濃縮樣品后進樣解吸，主要包括吹掃捕集（purge and trap，P&T）和微阱捕集（in-tube extraction，ITEX）。

靜態頂空采樣主要受容器溫度和平衡時間等因素的影響，樣品制備簡便，采集組分無干擾，但由于不同的香氣組分揮發性不同，其存在于容器頂空中的含量會不同，且該方法必須進行大體積的氣體進樣，會影響色譜的分離效果，僅適合高度揮發性或高含量組分的檢測。程凡等[10]用靜態頂空的方法測定酒醅中乙醇含量，蘆麗等[11]測定保健酒中的高級醇類和酯類，發現靜態頂空進樣適用于醇類及酯類等。SPME方法克服了傳統萃取技術進樣量大的缺點，集采樣、萃取、進樣、濃縮于一體，大大加快了分析檢測的效率，但卻過于依賴吸附涂層，不同萃取涂層所能萃取的物質不同，且效果差異較大[12]。

動態頂空是提取揮發性香氣物質常用的方法之一，具有方法簡便、快捷、無需溶劑的特點，而且提取的香氣成分逼真，最接近人體嗅覺所能感覺到的氣味。P&T有富集效率高、受基體干擾小、容易實現在線檢測等優點，但是此系統在提取低揮發性組分時效率較低[13]。利用P&T方法對香瓜和西瓜中的揮發性物質進行鑒定，共檢測到61種揮發性物質[14]。ITEX系統樣品量較少，且不易受污染、操作簡單、靈活，是一種用于自動進樣器的全自動微萃取技術[15]。采用ITEX-氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術研究了啤酒麥汁主發酵過程中揮發性風味物質的組成，由此通過高級醇、酯類、有機酸和醛類建立了不同產品等級的劃分方法[16]。然而，由于不同頂空萃取方法的特點及萃取效率不同，通過單一頂空萃取方式獲得的食品香氣信息并不全面。從珊等[17]比較了不同富集方法對植物油風味物質的影響，發現單一的富集方法對風味物質提取不全。目前單一的萃取技術均存在一定局限性，對比不同頂空萃取方式的差異，將不同頂空萃取方式進行融合，實現優勢互補，可以更加完整地獲取食品中的香氣物質信息。

本研究擬以不同基質體系下57種極性、沸點、保留指數（retention index，RI）跨度大的食品中常見的不同類型香氣物質作為研究對象，對比頂空SPME、ITEX、P&T、靜態頂空4種頂空進樣方式的萃取效率和能力，為GC-MS檢測食品中揮發性香氣物質的方法開發和應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-甲基-1-丁醇（純度98%）、二甲基二硫醚（純度98%）、丁酸乙酯（純度99.5%）、正丁酸（純度99.5%）、乙酸丁酯（純度99.7%）、糠醛（純度99.5%）、2-甲基丁酸（純度98%）、異戊酸（純度99.5%）、正己醇（純度99.5%）、苯乙烯（純度98%）、3-(甲硫基)丙醛（純度98%）、γ-丁內酯（純度98%）、2,5-二甲基吡嗪（純度98%）、己酸甲酯（純度99.5%）、苯甲醛（純度99.5%）、二甲基三硫（純度98%）、3-巰基-3-甲基-1-丁醇（純度98%）、苯酚（純度99.5%）、苯甲腈（純度99.5%）、甲基庚烯酮（純度98%）、月桂烯（純度90%）、己酸乙酯（純度99%）、雙戊烯（純度95%）、苯甲醇（純度99.9%）、苯乙醛（純度95%）、2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮（純度97%）、(E)-2-辛烯醛（純度95%）、苯乙酮（純度98%）、正辛醇（純度99.5%）、正庚酸（純度98%）、苯甲酸甲酯（純度98%）、壬醛（純度96%）、2-苯乙醇（純度99.5%）、1,2,4,5-四甲苯（純度99.8%）、乙酸糠硫醇酯（純度99%）、乙酸芐酯（純度99.7%）、L-薄荷醇（純度99.5%）、4’-甲基苯乙酮（純度98%）、苯甲醛二甲基縮醛（純度98%）、L-香芹醇（純度97%）、香茅醇（純度99%）、苯并噻唑（純度96%）、香葉醇（純度99%）、檸檬醛（純度97%）、麝香草酚（純度99.9%）、鄰氨基苯甲酸甲酯（純度99%）、椰子醛（純度98%）、香草醛（純度99%）、1,3-二甲基萘（純度95%）、異丁香酚（純度97%）、4-(2,6,6-三甲基-1-環己烯基)-3-丁烯-2-酮（純度97%）、香草酸甲酯（純度99%）、月桂酸（純度99.5%）、十七烷（純度99.5%）、十八烷（純度99.5%）、(＋)-諾卡酮（純度97%）、十八醇（純度99.5%）標準品 上海阿拉丁生化科技有限公司；氘代壬烷（DLM-2438-1，純度98%）、氘代十二烷（DLM-338-1，純度98%）、氘代十三烷（DLM-1354-0.1，純度98%）、氘代十六烷（DLM-203-0.1，純度98%）、氘代十九烷（DLM-1346-0.1，純度98%） 美國CIL公司；乙酸乙酯（色譜級）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

7890B/7010B GC-MS聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；Atomx全自動吹掃捕集濃縮儀 美國Tekmar公司；三位一體自動進樣器（SPME、靜態頂空、ITEX） 瑞士CTC Analytics公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、PDMS/DVB萃取頭、聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取頭、CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 香氣物質的提取

1.3.1.1 頂空SPME

取不同質量濃度梯度的標準品混標溶液990 μL于20 mL頂空進樣瓶中，并加入氘代烷烴（氘代壬烷、氘代十二烷、氘代十三烷、氘代十六烷、氘代十九烷）混標（100 μg/mL，10 μL）。其中標準品由水或自制食品基質溶液稀釋而成。樣品萃取前50 ℃預熱40 min。選用不同SPME進樣針對樣品進行萃取，萃取時間為30 min。萃取后的進樣針于進樣口260 ℃解吸附5 min進樣。SPME萃取頭分別為50/30 μm PDMS/DVB、PA、DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS。

1.3.1.2 ITEX

取不同質量濃度梯度的標準品混標溶液990 μL于20 mL頂空進樣瓶中，并加入氘代烷烴混標（100 μg/mL，10 μL）。其中標準品由水或自制食品基質溶液稀釋而成。樣品萃取前50 ℃預熱40 min。選用ITEX（Tenax TA 80/100）對樣品進行萃取，萃取針往返抽吸進樣瓶頂空氣體30 次，每次樣品體積1 mL，萃取體積0.5 mL，抽吸流速0.5 mL/s。萃取后的樣品于200 ℃進樣，進樣速率為0.1 mL/s。

1.3.1.3 P&T

使用聚四氟乙烯襯墊螺旋蓋的40 mL吹掃瓶，取不同質量濃度梯度的標準品混標溶液19.95 mL于P&T進樣瓶中，并加入氘代烷烴混標（100 μg/mL，10 μL）。其中標準品由水或自制食品基質溶液稀釋而成。P&T萃取（Trap #9捕集阱）過程中采用液體萃取模式，樣品進樣量為4 mL。吹掃時間40 min，吹掃溫度40 ℃，吹掃流量10 mL/min。解吸溫度250 ℃，解吸時間2 min。

1.3.1.4 靜態頂空

取不同質量濃度梯度的標準品混標溶液990 μL于20 mL頂空進樣瓶中，并加入氘代烷烴混標（100 μg/mL，10 μL）。其中標準品由水或自制食品基質溶液稀釋而成。樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，50 ℃孵育40 min。樣品體積為1 mL，進樣速率為0.5 mL/s。

1.3.2 香氣物質的定量分析

1.3.2.1 GC-MS檢測

采用毛細管色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）進行分離。進樣口溫度為260 ℃，采用不分流模式。載氣為氦氣，載氣流速為l mL/min。柱溫箱初始溫度為45 ℃，維持3 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃，并維持10 min。電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV。Scan掃描模式下，質量掃描范圍m/z40～400。

1.3.2.2 定量方法

采用多同位素內標校正結合外標法對不同化合物的含量進行定量分析。其中，同位素內標選用較為穩定的氘代烷烴（氘代壬烷、氘代十二烷、氘代十三烷、氘代十六烷、氘代十九烷）。定量方法采用單離子檢測掃描模式，選擇特征離子以及特征定量離子進行分析。取蝦夷扇貝的閉殼肌與0.9%的生理鹽水按1∶2（g/mL）進行混合制得簡易的食品基質。

1.4 數據處理

使用MassHunter系列分析軟件對采集的結果進行分析。利用Office 2016、Origin 2020、TBTools[18]、SPSS 22、SIMCA 14.1、Metaboanalyst 4[19]、XLSTAT等對數據進行統計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 香氣物質的選擇

物質的揮發性與分子之間的相互作用力以及自身的分子質量大小等性質相關。食品基質中的香氣物質主要可分為醛類、酮類、醇類、酯類、醚類、芳香族類以及碳氫化合物。不同類型的化合物性質差異較大。對于大部分食品的香氣，成分涵蓋廣而復雜，從而導致了香氣物質難以萃取完全，定性定量誤差較大等。因此，本研究選取57種來源于不同食品的揮發性物質，進行不同萃取方式定性定量分析差異的比較。特征香氣化合物種類包含烴類、酯類、醛類、醇類、酮類、酸類等主要類型化合物。其保留指數（retention index，RI）分布在700～2 000之間，涵蓋較廣，能夠一定程度上反映出食品中不同類型的特征香氣化合物色譜分離情況。同時，所選化合物的lgP值也均勻分布，分布范圍在－0.6～9.3之間，能夠體現出不同極性化合物的定量情況，從而進一步分析不同萃取方法萃取效率間的差異。對所選取的化合物進行色譜分離與質譜檢測，各香氣物質標準品性質如表1所示。

表1 不同揮發性香氣物質的性質Table 1 Properties of 57 volatile aroma compounds tested in this study

續表1

2.2 不同頂空進樣方法的差異分析

以GC-MS信號峰信噪比大于3作為可定性的衡量指標，通過對比相同濃度下不同頂空萃取方式，對重組香氣物質混合樣品萃取后質譜檢測所能鑒別出的化合物數量及相對強度判斷其萃取能力。為了進一步分析不同萃取方式萃取能力及與萃取物質之間的相關性，對結果進行統計學分析，如圖1所示。有20種揮發性風味化合物是所有方法均可測得的，不同萃取方法富集到的揮發性風味化合物存在明顯差異，這是由于富集材料的差異導致對不同分子質量、極性的揮發性化合物的吸附能力不同。雖然所選的4種不同類型SPME萃取頭的萃取能力在本實驗中沒有明顯差異，但由圖1B可以一定程度上判斷出PDMS/DVB萃取頭萃取效果最好，其在57種揮發性風味物質中可萃取到45種化合物，對醇類、酯類物質富集效果較好。ITEX動態頂空受溶劑影響較小，對RI較低的揮發性化合物的萃取能力較好，對芳香類化合物富集效果較理想。P&T對中高沸點的揮發性化合物富集效果較差，保留時間在16 min后的化合物只富集到1,3-二甲基萘和乙位紫羅蘭酮。除此之外，靜態頂空和P&T均不適合酸類物質的萃取。

圖1 不同萃取方法萃取能力對比Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of different extraction methods

結合圖1A與表2可知，P&T有11種風味化合物無法萃取獲得，分別為4’-甲基苯乙酮、L-香芹醇、香茅醇、苯并噻唑、香葉醇、檸檬醛、麝香草酚、鄰氨基苯甲酸甲酯、十七烷、十八烷、(＋)-諾卡酮，大部分屬于高沸點，高RI的化合物。靜態頂空SPME和動態頂空ITEX之間的萃取能力差異性相對較小，而與動態頂空P&T之間差異性較大，2種頂空方式之間也差異顯著，產生這種差異性可能與萃取材料的不同有關，可見相比較萃取形式，萃取頭的涂層材料對揮發性化合物的萃取能力影響更大。ITEX檢出的化合物中有2種SPME無法萃取得到，分別為二甲基二硫醚和2,5-二甲基吡嗪；而僅SPME方法能檢出ITEX無法檢出的化合物，分別為乙酸丁酯、異戊酸、正己醇、苯甲醇、2-苯乙醇等。說明在香氣物質分析時，可以將SPME與ITEX結合使用，從而獲得更全面的香氣化合物信息[22]。

對比溶劑萃取和頂空萃取之間的揮發性化合物差異，可以發現10種化合物在所有頂空萃取方法中均無法檢出（2-甲基-1-丁醇、二甲基二硫醚、正丁酸、2-甲基丁酸、γ-丁內酯、3-巰基-3-甲基-1-丁醇、苯酚、2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮、苯甲醛二甲基縮醛、十八醇）。說明這些揮發性化合物在進行指紋圖譜分析時，需結合其他頂空或溶劑萃取方式進行檢測。有文獻報道[23]，液液萃取和固相微萃取分離得到香氣物質的種類和相對含量有一定的差異，對某些特征風味成分的分離效果也存在差異，液液萃取能較好提取出酸類，SPME能較好地提取出酯類和醇類。樊艷[24]采用SPME方法對不同腐乳中揮發性物質進行提取，利用GC-MS的方法對其中的香氣物質進行定性分析，共鑒定出74種風味物質，其中醇類和酯類為主要的風味物質，表明SPME對酯類、醇類更為敏感，與本實驗研究結果一致。

2.3 頂空進樣方法對香氣物質定量的影響

所選同位素內標涵蓋了不同分子質量和RI的烷烴，對比不同萃取方式對不同同位素內標的萃取效果可以發現，SPME萃取頭PDMS/DVB更適合萃取中高RI的物質，而靜態頂空則適合中低RI的物質。從圖1B可以看出，不同萃取方法下同位素內標的響應值有明顯的差別。SPME萃取頭DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS與ITEX方法均對中等RI的化合物萃取效果較好。SPME萃取頭PA對氘代十六烷的萃取峰值明顯高于其他4種氘代烷烴，萃取效果較好，而對于氘代壬烷的萃取較差，ITEX方法中氘代壬烷的峰值高于其他幾種萃取方法。由于PA涂層的極性性質差異，通過實驗結果發現該類型SPME萃取頭更適合萃取中高質量數的極性半揮發性化合物，而ITEX相較于該類型SPME方法更適合萃取中低質量數化合物。因此，在萃取過程中針對不同萃取方式的特性進行結合，能夠有效互補各萃取方式的不足，從而獲得更全面的揮發性化合物信息。

SPME-PDMS/DVB、SPME-PA、靜態頂空和P&T對氘代壬烷萃取效果較差，因此氘代壬烷不適合作為SPME-PDMS/DVB、SPME-PA、靜態頂空和P&T萃取物低保留時間區域的定量內標。在對比的幾種萃取方式中，SPME-PDMS/DVB萃取頭對于氘代十二烷、氘代十三烷、氘代十六烷、氘代十九烷內標的響應值最高。對于氘代壬烷，ITEX的萃取效果最好。根據圖1B中P&T方法得到的5種氘代烷烴峰高顯著低于其他萃取方式，其余萃取方法均能富集到全部5種同位素內標，結合表2可以看出P&T萃取RI較大的化合物存在不足。據文獻報道[25]，多種同位素標記的內標用于通過補償可能影響頂空平衡和化合物可提取性的基質效應改善分析物的定量，基于SPME-GC-MS的優化同位素稀釋分析方法可以快速鑒定和量化液體煙中的揮發性化合物。Antignac等[26]研究表明用一般的內標進行定量分析時，相對標準偏差為32.6%，選用同位素內標進行定量分析時，相對標準偏差為5.7%。通過多同位素內標，可以一定程度補償可能影響頂空平衡和化合物可提取性的基質效應改善分析物的定量[27]。

對不同頂空萃取方法富集得到的香氣化合物進行質譜檢測，通過梯度稀釋法得到不同頂空萃取方法下不同化合物的檢出限和定量限，結果如表2所示。可以看出SPME萃取頭PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS以及ITEX富集痕量揮發性風味化合物效果較為理想，SPME對于醇類、酯類化合物更敏感（定量限均為20 ng/mL）。PDMS/DVB和DVB/CAR/PDMS萃取頭對痕量檢測醇類、酯類和烴類揮發性化合物效果較好。而ITEX更適合富集醛類、烴類揮發性化合物（醛類定量限為20 ng/mL，烴類定量限為10 ng/mL），檢測到的化合物最低回收率為84.30%，R2大于0.95。而靜態頂空與P&T痕量檢測效果相對較差，檢測到的醛類烴類數量少。對比不同方法的定量限可以發現SPME-PDMS/DVB對所選混合香氣樣品中絕大部分香氣化合物的定量限均較低。但是同樣存在部分化合物無法檢測到，以及部分化合物定量限相比其他頂空方法較高，例如苯甲醇、二甲基二硫醚、糠醛、2,5-二甲基吡嗪。

表2 不同頂空萃取方法檢出限和定量限對比Table 2 Comparison of detection and quantitation limits of different headspace sampling methods

從化合物類型看，由于不同化合物與萃取吸附涂層極性之間的差異導致化合物吸附效率不同，其中芳香族化合物和烴類化合物的檢出限較低，而酸類化合物的檢出限相對較高，與劉盛田等[28]利用靜態頂空條件和動態頂空分析水中苯系物的結果一致。靜態和動態頂空均能較好地分離與檢測芳香族化合物，這與秦丹等[29]檢測青稞酒中揮發性香氣物質的結果一致。

2.4 溶液基質成分對香氣物質定量的影響

在揮發性化合物檢測過程中，復雜的食品基質會影響揮發性物質的萃取，基質越復雜，揮發性物質檢測過程中的基質效應就越明顯。雖然在檢測過程中可以通過溶劑進行萃取，但在實際樣品揮發性物質分析過程中，更多的是要獲取食品原有狀態下的氣味輪廓。因此保持食品原有狀態進行揮發性化合物信息獲取更符合實際情況。

從圖2可以看出，整體而言，頂空方法獲得的食品香氣信息受食品基質的影響均較小，但不同頂空方法之間也存在差異。SPME進樣方式的DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB萃取頭在基質影響下萃取到的揮發性風味化合物個數變化小，CAR/PDMS、PA萃取頭與靜態頂空提取到的揮發性化合物個數變化相對較大，說明受基質影響較大。食品的復雜基質會影響食品中特征香氣物質的擴散，而對于頂空萃取而言，其主要是收集食品頂空的香氣物質，在溫度、壓力等條件的影響下，香氣物質會達到一定的氣液平衡，因此相對溶劑萃取而言，其獲得的氣味輪廓信息變化隨食品基質變化較小。

圖2 基質對不同頂空萃取方法檢出效果的影響Fig.2 Influence of matrix effect on the extraction efficiencies of different extraction methods

通過偏最小二乘回歸法對不同頂空萃取方式特征香氣物質定量情況及物質本身物理化學性質之間的關系進行綜合分析，進一步判斷不同頂空萃取方式的特點及所適合萃取的化合物類型。從圖3可以看出，基質效應對靜態頂空方式的萃取效率影響較大，而動態頂空萃取方式受到影響相對較小。這可能是由于靜態頂空萃取主要是依靠頂空瓶中的香氣物質脫離基體會散到頂空瓶上空達到氣液平衡。而當基體從水轉化成富含蛋白質、脂質、多糖等食品基質時，香氣物質揮散到頂空時受到的阻礙作用增加，從而受到影響較大。而當使用動態頂空萃取時，由于整個萃取過程存在外在氣體吹掃、抽吸等力的作用，會減少食品基質對香氣物質的阻礙作用。對比化合物性質與不同頂空萃取方式之間的關系可以發現，P&T、ITEX和靜態頂空方式的定量能力受化合物lgP、RI和分子質量的影響較大。P&T、ITEX和靜態頂空方式可能對中高極性的化合物的萃取趨勢更大。除此之外，可以看出頂空萃取方式更傾向于獲取中等RI揮發性化合物的定量信息。在實際檢測分析時，可以根據不同萃取方法特性進行結合，獲得更全面的香氣信息。因此，在有食品基質下檢測揮發性化合物可以優先結合SPMEPDMS/DVB萃取頭和ITEX萃取方法。

圖3 基質下不同萃取方法萃取能力與化合物性質關系偏最小二乘回歸分析Fig.3 Partial least squares regression analysis of the relationship between the extraction efficiencies of different extraction methods and the properties of compounds as influence by matrix effect

3 結 論

不同萃取方式對食品中香氣物質的富集存在明顯差異。香氣物質的頂空萃取方式由于吸附涂層的差別，會導致香氣物質的萃取量、萃取效率、萃取穩定性等發生變化。對于SPME方式而言，PDMS/DVB萃取頭更適合于水基質中特征香氣物質的富集；ITEX動態頂空方式結合了吸附填料、動態吹掃和微管濃縮等優勢，定量限為10 ng/mL，不僅能有效減少食品基質的影響，同時也提高了香氣化合物的萃取效率；P&T和靜態頂空更適合于低沸點化合物的定量。利用多種同位素內標在GC-MS檢測中RI的廣度分布結合不同頂空萃取方式，并通過不同保留時間進行合適的定量校正內標篩選，能夠有效提高食品中特征香氣物質的定量結果精度。通過對比不同頂空萃取方式的萃取能力，在優勢互補下將SPME與ITEX結合能夠有效提高獲得的食品香氣指紋信息的完整性與準確性。