基于檸檬酸-銪納米配位聚合物構建熒光探針快速檢測湯煲中5’-肌苷酸含量

高田毅，孫 沖，朱宏星，黃 楊，曹錦軒，王道營,

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315800；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

湯煲具有鮮美、營養價值高和保健功效等特點[1]，主要呈鮮物質是鮮味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸等）和核苷酸（5’-鳥苷酸、5’-肌苷酸等）[2-3]。其中，5’-肌苷酸（inosine-5’-monophosphate，5’-IMP）在鮮味成分中占主導地位，在雞肉、牛肉、豬肉中的含量分別為115、163、186 mg/100 g[4]。隨著社會經濟發展，國民生活水平大幅度提升，對食品品質也提出了更高要求，鮮味作為影響感官品質的重要因素，快速準確對5’-IMP含量進行檢測具有重要意義。

目前，對5’-IMP的常見檢測方法有薄層層析法[5]、紫外分光度法[6]、毛細管電泳[7]和高效液相色譜法[8]等。這些方法存在樣品預處理復雜、操作難度高、檢測成本高及儀器設備昂貴等缺點[9]。因此，亟需開發一種低成本、操作簡單、快速且適用于大量現場檢測的新方法，為實際產業中湯煲鮮味評價提供技術支持。

近年來，鑭系金屬離子與有機配體構建的鑭系配位聚合物（lanthanide coordination polymers，LCPs）受到科研人員的廣泛關注。LCPs是由鑭系離子和有機配體構建具有延展網絡結構的聚合物，由于其獨特的發光性能，存在區別于有機物熒光探針的尖銳發射峰，且熒光壽命長、生物相容性好、量子產率高等特點[10-12]，使LCPs在作為熒光探針方面具有獨特的優勢。根據檢測目標物與鑭系金屬離子和配體之間的作用，導致熒光信號發生變化，從而達到檢測目標物的目的[13]。Liu Baoxia等[14]將1,3,5-苯甲酸酯（1,3,5-benzenetricarboxylate，BTC）作為模板，以Cu2＋作為信號調節器和識別單元，合成Cu-BTC/Tb熒光探針，實現對阿爾茨海默氏癥的生物標志物淀粉樣蛋白β肽單體的檢測。Luo Yongquan等[15]基于鋱與亞甲基膦酸制備多孔膦酸鋱配位聚合物并將其應用于炭疽桿菌的檢測，在尿液和牛血清等實際樣品的檢測中，表現出良好的選擇性和穩定性。因此，鑭系配位聚合物納米粒子（lanthanide coordination polymer nanoparticles，LCP NPs）在生物檢測方面有巨大的應用潛力。

本研究通過一步法合成檸檬酸-銪金屬有機納米配體聚合物（citrate/europium lanthanide coordination polymer nanoparticles，Cit/Eu LCP NPs），其檢測原理如圖1所示。發散藍光的Cit/Eu LCP NPs與5’-IMP結合時由于—OH的伸縮振動，致使振動波和發射波重疊，Cit/Eu LCP NPs熒光信號猝滅[16]。因此，可將Cit/Eu LCP NPs作為熒光探針，通過熒光猝滅強度變化實現對5’-IMP快速準確的檢測。

圖1 Cit/Eu LCP NPs熒光檢測5’-IMP示意圖Fig.1 Schematic diagram for fluorescence detection of 5’-IMP through Cit/Eu LCP NPs

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞 市購；六水合硝酸銪、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5’-IMP、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；氯化銅、氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鈉、氯化鋁、氯化鎂、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水（18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Centrifμge 5810 R離心機 德國艾本徳公司；FE20/FG2 pH計、AL電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團；Direct-Q3uv超純水機 美國默克公司；Cytation5全波長酶標儀 美國伯騰公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡德國蔡司公司；Nicolet iS50傅里葉紅外變換光譜儀美國賽默飛公司；D2 Phaser X射線衍射儀 美國布魯克公司；FM-4P-TCSPC瞬態穩態熒光光譜儀美國Horiba公司；HJ-8(DF-1)集熱式磁力攪拌器 常州國華公司；Alpha 1-4 LD冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

100 mmol/L HEPES緩沖液制備：準確稱取HEPES粉末2.38 g，轉移至100 mL容量瓶中定容。用1 mol/L NaOH溶液調至pH 7.2，備用。

100 mmol/L檸檬酸三鈉溶液制備：準確稱取檸檬酸三鈉粉末2.58 g，轉移至100 mL容量瓶中定容，備用。

雞湯制備：將整雞內臟去除洗凈，切成約4 cm×4 cm的小塊稱質量，按照料液比1∶2（g/mL）加入清水，選擇電熱砂鍋慢燉模式。在燉煮過程中撇去表面浮油，將獲得的雞湯通過4 層脫脂紗布過濾，真空冷凍干燥備用。

1.3.2 Cit/Eu LCP NPs的制備

參考Liu Baoxia等[17]的方法。將5 mL硝酸銪六水合物溶液（100 mmol/L）加入2.5 mL檸檬酸三鈉溶液（100 mmol/L）中攪拌，室溫反應3.5 h后得到白色沉淀。將所得溶液8 000 r/min離心10 min，收集白色沉淀物并用去離子水洗滌數次以除去未反應物質。最后，將獲得的Cit/Eu LCP NPs凍干備用。

1.3.3 Cit/Eu LCP NPs的表征

1.3.3.1 傅里葉變換紅外光譜

采用壓片法制備樣品，實驗參數設置：掃描波長范圍為525～4 000 cm－1，分辨率為4.00 cm－1，掃描次數32。

1.3.3.2 X射線衍射

將粉末樣品研磨過篩（200 目）固定在樣品槽上。實驗參數：掃描范圍2θ為5°～85°，掃描電壓20 kV，掃描電流5 mA，Kα（λ=1.541 8 ?），掃描速率4 °/min，步寬0.02°。

1.3.3.3 掃描電子顯微鏡

將獲得Cit/Eu LCP NPs材料粉末超聲溶解后，涂于載玻片表面，干燥后將載玻片固定至掃描電子顯微鏡的樣品臺上，對樣品進行表面形貌的表征。實驗參數設置：加速電壓10 kV，真空度小于6×10－4Pa。

1.3.4 Cit/Eu LCP NPs熒光探針標準曲線的構建

將Cit/Eu LCP NPs粉末超聲溶解在5 mL HEPES緩沖液中（100 mmol/L，pH 7.2），制備成Cit/Eu LCPNP懸液備用，并配制質量濃度為2.5、5、10、25、50、100、200 μg/mL 5’-IMP溶液。取500 μL不同質量濃度5’-IMP溶液、200 μL Cit/Eu LCP NPs溶液、1 mL HEPES緩沖液混合并充分振蕩，并在25 ℃孵化20 min后通過全波長酶標儀測定熒光值。參數設置：發射波長（λEx）范圍為300～600 nm，固定激發波長（λEm）為250 nm，熒光增益為80，激發和發射狹縫均為20 nm，步幅設置為5 nm，通過計算猝滅的熒光變化值，建立與5’-IMP質量濃度的標準曲線。

1.3.5 實際雞湯樣品中5’-IMP含量的檢測

稱取50 mg凍干雞湯粉末定容至50 mL，8 000 r/min離心10 min，取上層清液。濾膜過濾（0.22 μm），去除多余的脂肪和雜質。通過向每個樣品中添加0、10、50 μg/mL的5’-IMP，根據1.3.3節方法測定熒光強度，計算Cit/Eu LCP NPs熒光探針的加標回收率。

1.4 數據統計

采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進行數據分析，采用Origin 8.5軟件進行譜圖繪制。

2 結果與分析

2.1 Cit/Eu LCP NPs材料的表征

為了證明Cit/Eu材料的成功制備以及Cit/Eu與IMP之間的配位作用，采用掃描電子顯微鏡，傅里葉紅外光譜及X射線衍射對Cit/Eu LCP NPs材料表征。如圖2A所示，Cit/Eu LCP NPs呈現外觀圓整的納米顆粒聚集結構，這與Xu Yuanyuan等[18]制備的一磷酸腺苷-鋱鑭系金屬聚合物具有相似的形貌。如圖2B所示，在曲線a中，1 383 cm－1處的吸收峰是由于—COOH不對稱拉伸振動產生的特征峰[19]；在曲線b中，隨著硝酸銪的加入，1 362 cm－1處的—OH特征峰與1 395 cm－1處的C—O特征峰的峰高均明顯上升，且1 588 cm－1處C＝O鍵的伸縮振動偏移至1 562 cm－1，表明Eu3＋通過羧基與檸檬酸三鈉配位[20]。在曲線c中，隨著5’-IMP的添加，1 078 cm－1與1 363 cm－1處的特征吸收峰顯著增強，說明5’-IMP與Cit/Eu LCP NPs通過PO43－基團和O—H鍵配位[21-22]。如圖2C所示，在2θ為27°和57°處展現出了明顯的銪特征峰[23]，上述結果表明Cit/Eu LCP NPs材料的成功合成。

圖2 Cit/Eu LCP NPs材料的表征結果Fig.2 Characterization of Cit/Eu LCP NPs

2.2 Cit/Eu LCP NPs熒光探針熒光性能的表征

如圖3A所示，由于檸檬酸對Eu3＋的天線效應，在250 nm的激發波長下，305 nm處出現尖銳的熒光峰。隨著5’-IMP的加入，由于—OH的伸縮振動導致了Cit/Eu LCP NPs熒光猝滅。如圖3B所示，Cit/Eu LCP NPs在波長250 nm處出現明顯的紫外吸收峰，當5’-IMP加入后，波長250 nm處的紫外吸收峰明顯降低，證明5’-IMP與Cit/Eu LCP NPs發生配位，導致熒光猝滅，這與熒光光譜的結果一致。如圖3C所示，Cit/Eu LCP NPs的熒光壽命為1.56 μs，相較于碳量子點[24]、CdS量子點[25]等納秒級（ns）的熒光壽命，Cit/Eu LCP NPs微秒級（μs）的熒光壽命有利于消除背景熒光影響，提高光能轉換效率[26-27]。

圖3 Cit/Eu LCP-NPs的紫外吸收與熒光特性分析Fig.3 UV-vis absorption spectra and fluorescence characteristics of Cit/Eu LCP-NPs

2.3 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的參數優化

不同實驗參數，如緩沖液pH值、孵化時間、孵化溫度等都會影響探針的性能。因此，對這些影響因素進行研究，通過熒光猝滅值（F0－F，F為待測組熒光值，F0為空白對照組熒光值）確定該熒光探針最佳的工作條件。如圖4A所示，當緩沖溶液pH值在6.8～7.4范圍內變化時，隨著pH值升高熒光猝滅值呈現不斷下降的趨勢，在pH值為7.2時，熒光猝滅值最低，此時待測組熒光值達到最大。但當緩沖溶液pH值大于7.2時，熒光猝滅值上升，這是由于偏酸性體系下Cit/Eu LCP NPs表面基團發生質子化，偏堿性體系下由于氫鍵作用聚集Cit/Eu LCP NPs團聚導致熒光衰減，而中性緩沖液環境下其表面基團趨于穩定[28-29]。因此選擇pH值為7.2作為最佳緩沖條件。如圖4B所示，隨著孵化時間的延長，熒光猝滅值逐漸減小，當結合時間為20 min時，熒光猝滅值已達穩定，說明Cit/Eu LCP NPs與5’-IMP結合完全。為了節省測試時間，選取20 min為最佳孵化時間。如圖4C所示，隨著孵化溫度的上升熒光猝滅值呈不斷下降趨勢，并在25 ℃處達到最低，當孵化溫度超過25 ℃時，熒光猝滅值則呈現趨勢上升。這是由于熱效應對于熒光強度的影響，溫度的上升導致更多的電子填充到Eu的電子空穴中，熒光強度發生變化[30]。因此，選擇最佳孵化溫度為25 ℃。

圖4 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的參數優化Fig.4 Parameter optimization for Cit/Eu LCP NPs fluorescent probe

2.4 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的選擇性、重復性及穩定性分析

具有良好靈敏度的探針不僅可以有效監測目標物的濃度，而且可以有效消除探針體系中其他物質的干擾。因此，選擇湯煲中常見的金屬離子、鮮味氨基酸進行該探針的抗干擾性分析。如圖5A所示，在相同實驗條件下選擇200 μg/mL的5’-IMP、Cu2＋、Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋、Cl－、Asp、Glu與空白組進行對照實驗，根據相對熒光強度F/F0（F為待測組熒光值，F0為空白對照組熒光值）評價熒光探針的選擇性。實驗結果表明，5’-IMP對波長305 nm處的熒光有效猝滅，相對熒光強度為51.64%，湯煲中常見的金屬離子、氨基酸相對熒光強度分別為Cu2＋（96.34%）、Na＋（103.99%）、K＋（106.51%）、Ca2＋（100.85%）、Mg2＋（98.65%）、Cl－（92.79%）、Asp（95.07%）、Glu（94.69%），對Cit/Eu LCP NPs檢測影響較小，說明本實驗構建的熒光探針具有良好的選擇性及抗干擾能力。在相同條件下對同一待測質量濃度的5’-IMP溶液進行重復檢測，得到相對標準偏差為3.09%。同時，將Cit/Eu熒光探針放入4 ℃冰箱中保存，連續5 d檢測其熒光強度，如圖5B所示，5 d后該熒光探針可以保持初始測定值的97.39%。因此，該熒光探針擁有良好的穩定性和重復性。

圖5 Cit/Eu LCP-NPs抗干擾性（A）和穩定性（B）Fig.5 Anti-interference ability (A) and stability (B) of Cit/Eu LCP-NPs

2.5 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的性能檢測

為了評估Cit/Eu LCP NPs熒光探針性能，將不同質量濃度5’-IMP溶液與Cit/Eu LCP NPs孵化后進行熒光檢測。如圖6所示，隨著5’-IMP溶液質量濃度的增加，Cit/Eu的熒光強度呈現線性降低，以5’-IMP質量濃度為橫坐標，相對熒光猝滅值為縱坐標，在2.5～200 μg/mL范圍內，Cit/Eu-IMP在波長250 nm處呈現良好的線性關系，線性方程為ΔI=12.70CIMP＋312.63（R2=0.993 0），檢出限為0.17 μg/mL。表1列舉了該熒光探針與其他5’-IMP檢測方法的參數對比。由表1可見，相較于其他5’-IMP的檢測方法，本實驗建立的熒光探針具有較低的檢出限和較寬的檢測范圍。

圖6 不同質量濃度IMP-Cit/Eu LCP-NPs的熒光光譜（A）和IMP質量濃度與熒光強度的關系（B）Fig.6 Fluorescence spectra of Cit/Eu LCP-NPs with different concentrations of IMP (A) and relationship between IMP concentration and fluorescence intensity (B)

表1 不同方法測定5’-IMP質量濃度的比較Table 1 Comparison of figures of merit of different methods for the determination of 5’-IMP

2.6 實際雞湯樣品中5’-IMP含量的檢測

為了驗證本實驗構建熒光探針的實際可行性，采用高效液相色譜法作為參比方法對雞湯中的5’-IMP進行檢測。采取加標回收實驗，在雞湯樣品中加入不同質量濃度5’-IMP（0、10 μg/mL和50 μg/mL），并對其進行檢測分析，如表2所示。該熒光探針測得回收率為97.85%～103.95%，相對標準偏差小于5%，該結果與高效液相色譜檢測結果基本一致，表明該熒光探針可用于實際肉品湯煲樣品中5’-IMP的檢測。

表2 2種方法測定雞湯樣品中5’-IMP的比較Table 2 Comparison of recoveries and precision of the fluorescent probe method and HPLC for 5’-IMP in chicken broth samples

3 結 論

本研究通過一步法合成Cit/Eu LCP NPs，采用掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射等對Cit/Eu LCP NPs進行表征。在此基礎上，構建基于Cit/Eu LCP NPs熒光探針用于湯煲中5’-IMP的檢測。在最優條件下，該熒光探針的線性范圍為2.5～200 μg/mL，線性方程為ΔI=12.70CIMP＋312.63（R2=0.993 0），檢出限為0.17 μg/mL，且該探針具有良好的穩定性、重復性和抗干擾性。在實際雞湯樣品的加標回收實驗中，測得回收率為97.85%～103.95%，檢測結果與高效液相色譜檢測結果一致。綜上所述，本實驗發展出具有優良檢測性能的鮮味熒光探針，為實際產業中高效快速評價提供新的思路和方法。