實時熒光跨越式滾環(huán)等溫擴增結(jié)合PMA檢測蝦產(chǎn)品中的活副溶血性弧菌

董 晶，徐 慧，郭 威，盧 鑫，張 偉,,3,

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院，河北 滄州 061100；3.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071000）

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）作為一種重要的食源性致病菌[1-4]，主要存在于蝦、蟹、牡蠣、蛤、扇貝及海魚等海鮮類產(chǎn)品中[5]。食用未完全煮熟的海鮮或被副溶血性弧菌污染的食物可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐、惡心、低燒等癥狀[6-8]。低溫處理在一定程度上可以抑制細菌的生長與繁殖[9]，但大部分細菌在低溫狀態(tài)下仍會保持活性。因此，副溶血性弧菌食物中毒的暴發(fā)多與食用海鮮類食品相關(guān)。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法（即GB 4789.7—2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》）公認度高、穩(wěn)定性好，但檢測周期較長，耗時費力[10]，且無法檢測出活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)的副溶血性弧菌[11]。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，核酸檢測技術(shù)成為近年來研究熱點之一，主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[12-13]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP）[14-17]、滾環(huán)等溫擴增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）[18-20]等，PCR和實時PCR（real-time PCR）檢測技術(shù)與傳統(tǒng)方法和免疫學方法相比，雖然有許多優(yōu)點，但是其相對于等溫擴增技術(shù)來說擴增效率較低，靈敏度亦較低。LAMP和RCA技術(shù)擴增效率及檢測靈敏度高，但LAMP反應(yīng)需4～6 條引物，引物間易相互反應(yīng)，發(fā)生非特異擴增，且無法通過測序驗證擴增產(chǎn)物的正確性。RCA技術(shù)擴增線性DNA時需要鎖式探針和連接酶，且需對探針進行環(huán)化，操作過程復(fù)雜，耗時長約4 h。

本研究團隊開發(fā)了一種新型核酸等溫擴增技術(shù)即跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)（saltatory rolling circle amplification，SRCA）[21-23]，原理如圖1所示。對于線性DNA的擴增，在60～65 ℃條件下，下引物（reverse primer，RVP）與模板鏈上的結(jié)合位點結(jié)合，在BstDNA聚合酶的作用下，沿模板鏈合成單鏈DNA（singlestranded DNA，ssDNA）（步驟①），隨后上引物（forward primer，F(xiàn)WP）與新合成的ssDNA上的互補序列結(jié)合（步驟②），在BstDNA聚合酶的鏈置換活性和聚合活性下，沿新合成的ssDNA邊合成邊置換，最終產(chǎn)生目的序列片段（步驟③）。以目的序列的一條鏈為例，由于ssDNA本身具有一定的空間二級結(jié)構(gòu)，靶序列的結(jié)構(gòu)近似為非閉合環(huán)狀，F(xiàn)WP與之結(jié)合（步驟④），并沿著靶序列擴增（步驟⑤）。在BstDNA聚合酶作用下，通過添加若干個堿基合成ssDNA，從而跨過靶序列兩端的“缺口”（步驟⑥）。繼而將先前合成的互補鏈置換下來，被置換下來的單鏈就像“卷尺”一樣不斷被拉長（步驟⑦）。同時，暴露出RVP結(jié)合位點，RVP與之結(jié)合并延伸（步驟⑧），并將先前合成的ssDNA置換下來（步驟⑨），被置換下來的ssDNA暴露出FWP結(jié)合位點，F(xiàn)WP與之結(jié)合并擴增（步驟⑩）。如此循環(huán)往復(fù)，最終擴增產(chǎn)物為以靶序列和添加序列為單元的多個重復(fù)序列的雙鏈DNA（步驟）。

圖1 SRCA反應(yīng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of SRCA assay

該技術(shù)與RCA技術(shù)相比，無需鎖式探針和連接酶以及人為環(huán)化過程，操作步驟簡單，耗時縮短約3 h，成本降低約3/4；與LAMP技術(shù)相比，所需引物數(shù)量減少，避免了引物之間的相互作用，成本降低約二分之一，可通過測序驗證擴增結(jié)果的正確性，已成功應(yīng)用于食源性病原菌的檢測[24-25]。

核酸檢測技術(shù)的一個共性問題是無法區(qū)分死菌與活菌。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）[26-27]染料可進入到死細胞中與dsDNA發(fā)生不可逆交聯(lián)反應(yīng)，并阻止其后續(xù)的擴增反應(yīng)[28-29]，但PMA染料無法穿過活細胞的細胞膜，因此可區(qū)分死菌與活菌[30]。

本研究以toxR基因為特異性靶基因[31]，通過大量預(yù)實驗篩選出了一對最合適的引物，建立檢測蝦產(chǎn)品中活副溶血性弧菌的PMA-RF-SRCA方法，并對此方法進行評價，旨在為食品中副溶血性弧菌的快速檢測與篩查提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品市購，詳情見表1。

表1 76 份實際樣品清單Table 1 List of 76 crustacean samples tested in this study

細菌全基因組DNA提取試劑盒、PMA染料、BstDNA聚合酶 大連寶生物工程有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix 北京索萊寶科技有限公司；DNA片段回收試劑盒、基因克隆T4載體 北京全式金生物技術(shù)有限公司；正、反向引物由北京華大基因合成。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀 中國Archimed Analyzer公司；Nanodrop 2000分光光度計 Gene company Limited基因有限公司；TGL16A臺式離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DXY-33A型電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像儀 北京君意電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將副溶血性弧菌（ATCC 17802）接種于3%氯化鈉堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基中，于37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，取1 mL菌懸液于新的3%氯化鈉堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)14 h制備指數(shù)期菌懸液，備用。其他菌株均在相應(yīng)培養(yǎng)基中純化備用。

1.3.2 死細胞的制備

采取加熱煮沸法制備死細胞。取1.3.1節(jié)中1 mL備用菌懸液于100 ℃持續(xù)沸騰加熱15 min，采用平板計數(shù)法確定細胞全部死亡。

1.3.3 PMA處理與基因組DNA的提取

向1 mg PMA染料中加入98 μL ddH2O，制備成20 mmol/L的PMA儲備溶液，于－20 ℃避光貯存。取1.3.1節(jié)備用菌液1 mL，按照細菌全基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取DNA，于－20 ℃貯存?zhèn)溆谩Ｈ?.3.2節(jié)熱處理后的菌液1 mL加入一定量的PMA儲備液，再經(jīng)過孵育、曝光處理后，按照細菌全基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取DNA，于－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 引物設(shè)計

選取toxR基因為靶基因，通過GenBank中的BLAST比對挑選出一條同源性高的序列作為靶序列，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計引物，引物序列詳細信息見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences used for amplification of toxR in this study

1.3.5 PMA處理條件的優(yōu)化

將所有樣品分成PMA處理組和未處理對照組。PMA處理組：將2 μL的PMA儲備液分別加入到1 mL備用純活菌及純死菌菌懸液中，于暗處處理5 min或10 min；接著進行曝光處理5、10、15、20 min；5 000 r/min離心10 min。以未經(jīng)PMA處理的純活菌及純死菌菌懸液為對照。

1.3.6 PMA-RF-SRCA方法的建立

PMA-RF-SRCA體系為：dNTPs（2.5 mmol/L）4.0 μL，Mg2＋（20.0 mmol/L） 3.0 μL，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL，F(xiàn)WP（10.0 μmol/L）1.0 μL，RVP（10.0 μmol/L）1.0 μL，DNA模板（71.1 ng/μL）1.0 μL（陰性不添加），BstDNA聚合酶（8 000 U/mL）1.5 μL，添加無菌去離子水將體系補足至20.0 μL。PMA-RF-SRCA的反應(yīng)利用熒光定量PCR儀進行，變性、退火、延伸均為同一溫度，反應(yīng)程序為62 ℃、15 s；62 ℃、80 s，60（或45）個循環(huán)，每個循環(huán)采集一次信號；80 ℃、5 min。

1.3.7 PMA-real-time PCR方法的建立

PMA-real-time PCR體系為2×TaqPCR MasterMix 11.0 μL，正、反向引物各添加1.0 μL，模板1.0 μL（陰性不添加），無菌去離子水補足體系至25.0 μL。利用熒光定量PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)采集一次信號。

1.3.8 產(chǎn)物測序分析

用凝膠電泳法對SRCA擴增結(jié)果進行分析，在紫外燈下從下往上選取3～4 條清晰條帶進行連接、轉(zhuǎn)化、純化、菌液驗證等操作，并送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序分析。

1.3.9 PMA-RF-SRCA特異性實驗

菌株信息如表3所示，共選取30 株菌株，包括12 株副溶血性弧菌和18 株非副溶血性弧菌。分別提取模板DNA，用建立的PMA-RF-SRCA方法進行結(jié)果判定。

表3 本研究所用菌種Table 3 Bacterial strains used in this study

續(xù)表3

1.3.10 靈敏度實驗

為分析PMA-RF-SRCA檢測純菌液的靈敏度，取1 mL備用菌液進行10 倍梯度稀釋，獲得濃度為3.2×109～3.2×100CFU/mL的菌懸液，提取模板DNA后分別進行PMA-RF-SRCA及PMA-real-time PCR，以熒光曲線法對反應(yīng)結(jié)果進行分析，并比較2種方法的靈敏度。

1.3.11 檢出限實驗

選用蝦產(chǎn)品作為實驗樣品，對所有實驗樣品先進行巴氏滅菌，使用GB 4789.7—2013驗證不含活副溶血性弧菌。將已知濃度的備用純菌懸液加入到25 g陰性樣品中，采用國標法進行計數(shù)，用均質(zhì)液依次進行10 倍梯度稀釋，制得濃度梯度為2.08×108～2.08×101CFU/g的人工污染樣本，未接種的樣品作為陰性對照，分別進行PMARF-SRCA及PMA-real-time PCR，以熒光曲線法對反應(yīng)結(jié)果進行分析，并確定2種方法的檢出限。

1.3.12 PMA-RF-SRCA方法的實際應(yīng)用與評價

為探究PMA-RF-SRCA方法對實際樣品中副溶血性弧菌的檢出情況，對76 份蝦產(chǎn)品（表1）進行檢測，將PMA-RF-SRCA方法與PMA-real-time PCR及GB 4789.7—2013進行對比，每次實驗均重復(fù)3 次，分別計算3種方法的陽性檢出率，并計算相對敏感性、相對特異性、相對符合率評估此方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2018軟件及IBM SPSS Statistics 26軟件通過單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA處理條件優(yōu)化

使用濃度為3.2×109CFU/mL的活副溶血性弧菌菌懸液進行實驗，每組實驗均重復(fù)3 次，PMA處理條件優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。孵育10 min和光照15 min時活細胞數(shù)量最多，且與其他處理組之間具有顯著差異（P＜0.05）；并且在該PMA處理條件下，RF-SRCA方法無法檢測到擴增信號，表明該條件下死細胞DNA的擴增被完全抑制。故本實驗選取PMA孵育10 min和光照15 min為PMA處理的最佳條件。

圖2 PMA處理條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of PMA processing conditions

2.2 產(chǎn)物測序分析

測序結(jié)果如圖3所示，結(jié)合基因組序列及圖3B可知，SRCA跨環(huán)時添加的堿基包括FWP上游序列的4 個堿基和RVP互補序列下游序列的3 個堿基，SRCA擴增產(chǎn)物為以靶序列和添加序列為單元的多個串聯(lián)重復(fù)序列，SRCA擴增結(jié)果與反應(yīng)原理一致。

圖3 副溶血性弧菌SRCA反應(yīng)的電泳和測序結(jié)果分析Fig.3 Electrophoresis and sequencing of SRCA products of V.parahaemolyticus

2.3 PMA-RF-SRCA特異性分析

采用實時熒光曲線法對引物進行特異性分析。如圖4及表3所示，12 株副溶血性弧菌均成功擴增出了熒光曲線且具有單一的溶解峰（（83.699±0.4）℃），判定為陽性，而18 株非副溶血性弧菌沒有擴增出熒光曲線，判定為陰性。結(jié)果表明，PMA-RF-SRCA方法具有良好的特異性，可用于副溶血性弧菌的鑒定與篩查。

圖4 熒光曲線法特異性分析Fig.4 Fluorescence amplification curves showing the specificity of PMA-RF-SRCA

2.4 靈敏度實驗結(jié)果

對處于指數(shù)生長期的菌懸液（終濃度為3.2×109CFU/mL）進行10 倍梯度稀釋，提取各稀釋度菌懸液的DNA后分別進行PMA-RF-SRCA及PMA-real-time PCR。由圖5A可知，對于PMA-RF-SRCA反應(yīng)，當細胞濃度為3.2×109～3.2×100CFU/mL時，均可成功擴增出熒光曲線，故PMA-RF-SRCA方法的靈敏度為3.2×100CFU/mL。由圖5B可知，對于PMA-real-time PCR，當細胞濃度為3.2×109～3.2×102CFU/mL時，均可成功擴增出熒光曲線，但當細胞濃度降低到3.2×101CFU/mL時已觀察不到熒光曲線，故PMA-real-time PCR方法的靈敏度為3.2×102CFU/mL。PMA-RF-SRCA方法的靈敏度是PMA-real-time PCR的100 倍。

2.5 檢出限實驗結(jié)果

將人工污染的蝦產(chǎn)品樣本按照GB 4789.7—2013進行前處理，利用均質(zhì)液進行10 倍梯度稀釋，菌液濃度為2.08×108～2.08×100CFU/g。提取模板DNA后分別進行PMA-RF-SRCA反應(yīng)及PMA-real-time PCR。如圖6A所示，對于PMA-RF-SRCA反應(yīng)，當菌液濃度為2.08×108～2.08×101CFU/g時，均可成功擴增出熒光曲線，故此方法的檢出限為2.08×101CFU/g。對于PMA-real-time PCR（圖6B），當菌液濃度降低到2.08×102CFU/g 時，不再擴增出熒光曲線，故此方法的檢出限為2.08×103CFU/g。因此，PMA-RF-SRCA方法的檢出限低至PMA-real-time PCR的1/100。

圖6 檢出限檢測分析Fig.6 Determination of detection limit of PMA-RF-SRCA and PMA-real-time PCR

2.6 PMA-RF-SRCA方法的實際應(yīng)用與評價

分別用GB 4789.7—2013、PMA-RF-SRCA、PMA-real-time PCR 3種方法對76 份蝦產(chǎn)品樣本進行檢測。以GB 4789.7—2013為標準，結(jié)果如表4所示。國標法陽性樣品檢出數(shù)為51 個，陰性樣品數(shù)為25 個，其陽性樣品檢出率為67.11%（51/76）；PMA-RT-SRCA法陽性樣品檢出數(shù)為52 個，真陽性為51 個，假陽性為1 個，真陰性為24 個，故陽性樣品檢出率為68.42%（52/76）；PMA-realtime PCR法陽性樣品檢出數(shù)為53 個，真陽性為51 個，假陽性為2 個，真陰性為23 個，故陽性樣品檢出率為69.74%（53/76）；以GB 4789.7—2013方法為基準，經(jīng)計算[22,32-34]，PMA-RF-SRCA方法的相對敏感性為100.00%，相對特異性為96.00%，相對符合率為98.68%；PMA-real-time PCR方法的相對敏感性為100.00%，相對特異性為92.00%，相對符合率為97.37%。

表4 PMA-RF-SRCA及PMA-real-time PCR方法評估Table 4 Evaluation of PMA-RF-SRCA and PMA-real-time PCR

3 結(jié) 論

本研究成功建立了用于檢測蝦產(chǎn)品中活副溶血性弧菌的PMA-RF-SRCA方法，通過測序分析驗證了擴增結(jié)果的正確性，檢測時間大大縮短。使用40 mmol/L的PMA處理濃度和3.2×109CFU/mL的死/活副溶血性弧菌對PMA處理條件進行優(yōu)化，得出PMA的最佳孵育時間為10 min，曝光時間為15 min。利用PMA-RF-SRCA方法進行特異性實驗，12 株副溶血性弧菌均呈陽性，18 株非副溶血性弧菌均呈陰性，結(jié)果證明本方法具有較強的特異性。PMA-RF-SRCA檢測副溶血性弧菌純菌液的靈敏度為3.2×100CFU/mL，是PMA-real-time PCR的方法高100 倍；人工污染的蝦產(chǎn)品樣本中副溶血性弧菌的檢出限為2.08×101CFU/g，低至PMA-real-time PCR的1/100。利用PMA-RF-SRCA、PMA-real-time PCR及GB 4789.7—2013方法對76 份實際樣品進行檢測，國標法陽性檢出率為67.11%，PMA-RF-SRCA及PMA-real-time PCR方法陽性檢出率分別為68.42%、69.74%。以GB 4789.7—2013為標準，PMA-RF-SRCA的相對敏感性為100.00%，相對特異性為96.00%，相對符合率為98.68%；PMA-real-time PCR的相對敏感性為100.00%，相對特異性為92.00%，相對符合率為97.37%。