外泌體非編碼RNA調控骨髓間充質干細胞成骨分化的研究進展

谷營營 藺一凡 鄭天霞 董偉

華北理工大學口腔醫學院，河北 唐山 063210

骨髓間充質干細胞( bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚層細胞，增殖能力強，分化譜系多[1]，可在不同誘導條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、基質細胞、神經細胞等[2]，具有自我更新、成骨分化及免疫調節等功能[3]。骨再生是一個復雜而高度調控的過程，有膜內骨化和軟骨內骨化兩種不同的方式，在膜內骨化過程中，由BMSCs成骨分化而來的成骨細胞形成骨[4]，故可以通過調控BMSCs骨向分化促進骨再生[5]。BMSCs的成骨分化功能在骨組織工程中極具應用前景[6]，研究調控其骨向分化的分子機制對骨科領域具有重大意義。

外泌體(exosomes)是一種由細胞內多胞體與胞膜融合后再釋放到細胞外環境的納米級膜性脂質囊泡，富含核酸、蛋白質、膽固醇等多種生物活性物質[7]。研究[8]發現，外泌體源性非編碼RNA主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環狀RNA(circular RNA，circRNA)，可以通過多種作用機制調控BMSCs成骨分化。外泌體通過旁分泌途徑表達生物學效應[9]，運輸生物活性物質調控細胞間通訊[10]，無信息傳遞屏障等特殊的生物學特性，在介導非編碼RNA調控BMSCs成骨分化過程中極大的提高了信息傳遞效率[11]，使其在骨質疏松癥等骨代謝類疾病診斷及治療方面更具臨床優勢，本文就此研究進展做一綜述。

1 外泌體miRNA對BMSCs成骨分化作用機制

MiRNA是一類長度大約18～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與目標RNA結合，參與調控翻譯后的基因沉默，抑制相關基因表達[12]。早在2014年，Xu等[13]對BMSCs來源的外泌體miRNAs在調控BMSCs成骨分化過程中的表達譜分析中發現，9種miRNAs(miR-203、miR-218、miR-219、let-7a、miR-148a、miR-135b、miR-199b、miR-302b和miR-299-5p)被上調促進成骨分化；5種miRNAs(miR-155、miR-221、miR-181a、miR-320c和miR-885-5p)被下調，抑制BMSCs成骨分化。

研究表明，外泌體miRNA可以通過不同調控途徑促進BMSCs成骨分化(圖1a)。Chen等[14]發現，小鼠受體BMSCs能夠從間充質干細胞移植(mesenchymal stem cells transplantation，MSCT)供體中攝取其包含的外泌體及miR-151-5p，通過過表達miR-151-5p抑制白細胞介素-4(IL4)/IL4Rα表達，下調磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)水平及其通路的級聯反應，促進成骨基因Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx 2)、堿性磷酸酶(alkaline Phosphatase，ALP)及骨鈣素(osteocalcin，OCN)表達上調，促進成骨分化。Wang等[15]研究發現，來自于間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的外泌體源性miR-21在BMSCs成骨分化過程中表達上調，通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K),磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-AKT)及糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)通路及靶向結合成骨分化抑制劑Spry1和Sox2發揮作用，上調Runx2表達促進BMSCs成骨分化。

外泌體miRNA還可以抑制BMSCs骨向分化(圖1b)。來自MSCs分泌的外泌體miR-31通過下調Runx 2的下游成骨轉錄因子(osterix，OSX)和SATB2抑制BMSCs成骨分化[15]。此外，血紅素加氧酶1(Hmox-1)可以促進BMSCs的生長和成骨分化[16]，而Hmox-1可以作為miR-183-5p的結合靶點[17]。以此為基礎Davis等[18]發現，用來自骨髓間質液(bone marrow stromal fluid，BMSF)的外泌體miR-183-5p 模擬物轉染BMSCs后會降低miR-183-5p靶向調控Hmox-1的蛋白水平，抑制BMSCs成骨分化。Liu等[19]發現過表達外源性miR-155會導致BMSCs成骨分化過程中ALP降低，下調成骨相關骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、OCN及OSX的表達，抑制BMSCs成骨分化；該研究還檢測到Runx 2和骨形態發生蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)是miR-155的兩個直接靶基因，上調Runx 2和BMPR 2表達也可以抑制骨向分化。Liu等的實驗只是提示miR-155來源于外泌體的可能性較大，但并未以實驗確定，故后續研究可以以此為基礎完善此作用機制。

還有研究表明，在外泌體源性miRNA調控BMSCs成骨分化過程中，改變miRNA表達水平后，其對BMSCs成骨分化的作用也隨之改變(圖1c)。Chen等[20]研究報道，當人脂肪間充質干細胞(human adipose-derived stem cells，HADSCS)來源的外泌體miR-375表達降低后，其3′-非翻譯區(3′-UTR)會抑制胰島素樣生長因子結合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)表達，進而抑制BMSCs成骨分化；過表達miR-375后則促進BMSCs成骨分化。Qin等[21]發現，BMSCs來源的外泌體刺激BMSCs成骨分化，可能的調控機制是外泌體中高度富集的3種miRNA(miR-196a，miR-27a和miR-206)參與調控成骨分化，且其表達量高低會影響對BMSCs成骨分化的促進或抑制作用。

圖1 外泌體miRNA對BMSCs成骨分化作用機制示意圖Fig.1 Mechanism of exosomal miRNA on BMSCs osteogenic differentiation注：a: miRNA通過不同途徑促進BMSCs成骨分化; b: miRNA通過不同途徑抑制BMSCs骨向分化; c: 改變miRNA表達水平后，其對BMSCs成骨分化的作用隨之改變。

綜上可知，外泌體miRNA對BMSCs的成骨分化作用機制既有調控成骨分化相關基因表達，也有參與成骨分化信號通路調節，還可調控miRNA下游靶基因從而調控BMSCs成骨分化。然而，目前對外泌體源性miRNA的研究雖多，但關于其對BMSCs成骨分化的調控機制、作用時相應下游靶基因、表達時序性以及全身相關性疾病等問題的認識還是很局限，仍需進一步研究，以為臨床診斷和治療提供更為精確的靶點與方向。

2 外泌體lncRNA對BMSCs成骨分化作用機制

LncRNA是長度大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA的一員[21]，比miRNA和circRNA序列更長，空間結構更復雜，穩定性更差且更易降解[22]，有研究[23]提示，在病理情況下lncRNA在外泌體中表達量比在細胞中表達量高，且可規避其被內源性RNA酶降解的風險，故經由外泌體進行物質交換和信息傳遞可提高lncRNA運輸時的穩定性[24]，深入分析外泌體源性lncRNA對BMSCs成骨分化的作用機制極具研究價值和臨床實用性。

研究發現，lncRNA可以促進BMSCs成骨分化。Zhang等[25]通過基因芯片檢測技術和生物信息學分析篩選出了在BMSCs成骨分化過程中相關的1 048條lncRNA，深入研究后發現lncRNA XR-11150通過上調Runx 2表達促進BMSCs成骨分化。還有研究報道[26]，小干擾RNA(siRNA)轉染lncRNA-DANCR后降低DANCR表達，促進BMSCs增殖及成骨分化，而過表達DANCR時，激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路，抑制BMSCs增殖和成骨分化(圖2a)。目前的研究只提示了經由外泌體介導lncRNA促成骨分化效率更高，穩定性更好，但缺乏精確的實驗數據證明lncRNA來源于外泌體，有待繼續探索，以找尋更高效便捷的作用途徑。

外泌體源性lncRNA也可以抑制BMSCs成骨分化。Li等[27]發現，骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細胞來源的外泌體含有豐富的lncRNA Runx2-AS1，通過在重疊區域與Runx 2 premRNA形成RNA雙鏈，降低剪接效率抑制BMSCs中Runx 2的表達，從而降低BMSCs的成骨分化潛能，且研究結果提示外泌體源性lncRNA Runx 2-AS1可能成為MM病變的潛在治療靶點，更具研究意義(圖2b)。Wang等[28]用微陣列技術確定腫瘤源性外泌體處理的BMSCs中lncRNA的全基因組表達模式后發現，腫瘤源性外泌體可通過差異表達lncRNA降低BMSCs內lncRNA和mRNA的表達水平，進而抑制BMSCs成骨分化，但其具體分子作用機制并未研究，有待深入探索。

盡管目前lncRNA已經成為研究熱點，但關于外泌體源性lncRNA對BMSCs成骨分化作用的研究仍存在許多未知，有待深入研究，發現更多具有調控成骨分化作用的lncRNA以及更為精準的調控通路，為骨再生機制提供更多的可能性。

3 外泌體circRNA對BMSCs成骨分化作用機制

CircRNA是一類含有共價閉合環狀結構的具有高穩定性、高保守性且被證明在外泌體中含量豐富的內源性非編碼RNA[29]。外泌體源性circRNA已經開始在癌癥研究的新領域中發揮功能性作用，參與胃癌和腫瘤的發生，發展及轉移[30-31]，作為腫瘤性疾病的診斷標志物發揮了極大的作用[32]，但對BMSCs成骨分化作用機制的研究鮮有報道。

近期研究發現，外泌體源性circRNA可以作為miRNA分子海綿參與信號通路，調控BMSCs成骨分化。Zhang等[33]對BMSCs成骨分化過程中circRNAs的表達譜進行了微陣列分析，發現共有3 938個circRNAs上調，1 505個下調，并發現此過程中表達的circRNAs可以從基因組的所有區域合成，但主要來源于外泌體，經研究驗證部分外泌體來源的circRNA與miRNA間呈負相關且具有miRNA反應元件，其中circRNA IGSF11沉默后提高了miR-199b-5p的表達水平，激活GSK-3β通路，促進BMSCs成骨分化(圖2c)。

另外Yang等[34]在骨質疏松癥(osteoporosis，OP)患者血清中發現，其miR-217水平較未患OP者高，miR-217通過靶向結合Runx 2的3′UTR位點降解Runx 2，抑制成骨分化；血清外泌體中circRNA VANGL1(circ-VANGL1)通過結合miR-217阻斷其降低Runx 2表達的抑制成骨作用，且過表達circ-VANGL1后，ALP、Runx 2、OPN和OCN等表達均上調，促進BMSCs成骨分化。但Yang等的實驗并未涉及circ-VANGL1是否能夠單獨作用以及circ-VANGL1能否與其他miRNA或mRNA位點結合，有待進一步研究，以期為促進骨再生提供新的治療途徑與方法(圖2 d)。

圖2 外泌體lncRNA和circRNA對BMSCs成骨分化作用機制示意圖Fig.2 The mechanism of exosomes lncRNA and circRNA on BMSCs osteogenic differentiation注：a: lncRNA-DANCR通過不同途徑抑制BMSCs成骨分化; b: lncRNA抑制BMSCs成骨分化; c: circRNA抑制BMSCs成骨分化；d: circRNA VANGL1通過不同途徑促進BMSCs成骨分化。

綜上所述，雖然circRNA在細胞生命活動、全身疾病的發生發展及作為疾病診斷早期標志物方面都顯露了巨大的潛力[35-36]，但circRNAs的豐度較低，很難在外泌體中精確檢測到，具有很大的挑戰性，且其在外泌體中富集的機制可能是胞質中本就富含circRNAs，被動包含在外泌體中，也可能是circRNAs從細胞質主動轉移，目前尚未有明確定論，故深入探究circRNAs是如何富集到外泌體中的及其調控BMSCs成骨分化的具體作用機制，有助于開創新的研究思路，并為骨科疾病提供全新的治療體系。

4 小結與展望

已有多項研究報道外泌體對BMSCs成骨分化具有調控作用，如人臍帶來源MSCs分泌的外泌體通過上調OCN、ALP、BMP 2、OSX、Runx 2等成骨相關基因，促進BMSCs成骨分化[37]。BMSCs來源外泌體通過促進BMP 9、Runx 2、OSX等表達促進成骨分化，或通過促血管再生、鈣化沉積、黏附Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白等細胞外基質附著于骨表面，間接誘導BMSCs骨向分化[38]。但關于外泌體內容物非編碼RNA對BMSCs成骨分化的研究仍有限，目前已發現的研究機制主要集中在調控成骨分化相關基因表達、激活或抑制成骨分化相關通路、影響成骨上下游靶基因表達水平以及參與成骨分化相關蛋白表達等，多數研究是miRNA調控BMSCs成骨分化的作用，關于lncRNA和circRNA的相關研究較少，是未來的熱點研究方向。此外，實現更加高效提純外泌體非編碼RNA成分并保證其生物學活性、發現更多能夠調控BMSCs成骨分化的途徑以及探索更多調控BMSCs成骨分化的作用機制等都有待研究。故深入研究外泌體非編碼RNA對BMSCs發揮調控作用的成分并明確其調控BMSCs成骨分化的具體作用機制，有助于研發促進骨再生、抑制骨吸收的新途徑和方法，對臨床預防和治療骨質疏松類疾病具有重要意義，研究及應用前景十分良好。