流感病毒感染患者外周血中NKG2D及細胞因子水平變化的研究

涂海霞，曹敏，王守星，于青云，黃河

南京醫科大學附屬逸夫醫院病理與臨床檢驗中心，江蘇南京 211100

流感病毒是臨床中較為常見的呼吸道感染病原體，常造成鼻腔、咽喉部的急性炎癥，影響著人類的身體健康及生活質量[1]。NKG2D是NK細胞表面的活化性受體，屬于跨膜性受體，分子量大約為42kD，能與MHC-Ⅰ類相關分子Α和B結合，通過PI3K通路，利用相關DAP10多肽活化NK細胞的活性[2-3]。有研究表明，NKG2D和它的多種配體共同組成的一個強大的壓力誘導監測系統，可以對受感染、發炎和惡性轉化的細胞產生一定的抵抗作用，并且在抗腫瘤免疫監視中起決定性作用[4-5]。流感病毒感染呼吸道上皮細胞后，還誘導產生一系列促炎癥因子。細胞因子是由多種細胞(特別是免疫細胞)所產生、具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質。細胞因子種類繁多、功能各異，它們在免疫細胞的分化發育、免疫調節、炎癥反應中發揮重要作用[6-7]。該研究通過檢測該院2019年3—4月流感爆發期間44例流感病毒感染患者及同期55名體檢健康者的外周血中表面受體NKG2D及一系列細胞因子的表達變化，旨在了解流感患者機體免疫狀態的變化，方便臨床對疾病的早期診療，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

經南京醫科大學附屬逸夫醫院倫理委員會批準及患者知情同意，選取該院流感爆發期間共44例臨床診斷為流感病毒感染的門診患者作為疾病組，其中男性18例，女性26例；年齡16～63歲，平均年齡（31.91±1.93）歲。選取同期55名體檢健康者作為對照組，其中男性26名，女性29名；年齡21～65歲，平均年齡（31.55±1.42）歲。采集兩組EDTΑ抗凝的新鮮外周血2 mL和對應血清2 mL，進行WBC及五分類計數，使用流式細胞儀進行CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、NKG2D及細胞因子表達水平的檢測。

1.2 主要儀器與試劑

①WBC五分類:采用希森美康XN-B3進行檢測，試劑購自希森美康；②CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、NKG2D、細胞因子：使用BECMAN公司的FC500流式細胞儀進行檢測，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+及溶血素試劑購自北京同生時代；NKG2D試劑購自BD公司；細胞因子購自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WBC五分類 使用半導體激光流式細胞技術結合核酸熒光染色技術。

1.3.2 淋巴細胞亞群分析及NKG2D的檢測 分別使用熒光標記的單克隆抗體組合1（CD45PC7、CD4FITC/CD8PE/CD3PC5）和組合2（CD3FITC/CD16+56PE、NKG2DPC5.5）對研究對象外周全血進行染色，組合2另設對照管（管內不加入NKG2DPC5.5標記，其余制備方法完全相同）。取50μl EDTΑ抗凝血，室溫避光15 min，加入經10倍稀釋的免洗溶血素500μl，室溫避光15 min，樣本溶血充分后使用流式細胞儀FC500檢測，使用CXP Cytometer軟件進行分析。

細胞亞群設門策略：組合1中T1為白細胞群，以T1為門，定義CD3+為T細胞群（T2），再以T2為門，分別定義出CD3+CD4+T細胞群（T3）和CD3+CD8+T細胞群（T4），見圖1；組合2中N1為白細胞群，以N1為門，定義CD3-CD16+56+細胞為NK（N2）和CD3+CD16+56+細胞為NKT（N3），最終分析NK其表面活化性相關受體NKG2D表達的百分含量，見圖2。

圖1 組合1淋巴細胞亞群分析方案

圖2 組合2淋巴細胞亞群分析方案

1.3.3 細胞因子檢測 兩組血液標本采集30 min后，4 000 rpm離心5 min，取25μl樣本，分別加入25μl實驗緩沖液、25捕獲微球檢測抗體、25μl檢測抗體，避光震蕩2 h后加入25μl染料，避光震蕩30 min。加10×洗滌液300μl，300～400 g常溫離心5 min，使用流式細胞儀FC500進行檢測分析。

1.4 統計方法

使用SPSS 20.0統計學軟件分析處理數據，采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗數據的正態性，正態分布的計量資料使用（±s）表示，組間比較采用t檢驗;非正態分布的計量資料用中位數（M）和四分位數間距（M25，M75）表示，組間比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疾病組與對照組性別、年齡及WBC水平比較

將疾病組與對照組年齡、性別和WBC水平分別進行K‐S檢驗，其中性別、WBC呈正態分布（P＞0.05），年齡呈非正態分布（P＜0.05）。正態分布數據進行t檢驗，非正態分布數據使用Mann-WhitneyU檢驗，結果顯示，疾病組與對照組年齡、性別及WBC水平差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 疾病組與對照組WBC水平比較

2.2 疾病組與對照組WBC五分類計數水平比較

在兩組WBC對比差異無統計學意義的基礎上，對WBC進行五分類計數，將疾病組與對照組分類計數水平分別進行K-S檢驗，其中單核細胞、淋巴細胞、嗜堿性粒細胞呈正態分布（P＞0.05），進行t檢驗；中性粒細胞、嗜酸性粒細胞呈非正態分布（P＜0.05），使用Mann-WhitneyU檢驗。結果顯示，兩組中性粒細胞、嗜酸性粒細胞差異無統計學意義（P＞0.05），而單核細胞、淋巴細胞、嗜堿性粒細胞計數差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 疾病組與對照組WBC五分類計數水平比較

2.3 疾病組與對照組淋巴細胞亞群表達水平比較

在正常WBC分類中，單核細胞和嗜堿性粒細胞所占比例不超過10%，淋巴細胞占20%～50%，故使用流式細胞術對淋巴細胞亞群結果進行再一步分析，除CD3+CD16+56+呈非正態分布（P＜0.05），其余指標均呈正態分布（P＞0.05）。檢測后發現兩組CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD16+CD56+差異無統計學意義（P＞0.05），而NKG2D表達水平差異有統計學意義（t=3.670,P=0.001），見表3。

表3 疾病組與對照組淋巴細胞亞群表達水平比較

2.4 疾病組與對照組細胞因子表達水平比較

細胞因子在免疫調節、炎癥應答等生理和病理過程中均發揮著重要作用，使用流式細胞術對細胞因子表達水平進行分析，檢測數據均呈非正態分布，使用Mann-WhitneyU檢驗后發現兩組IL-17和TNF-α差異無統計學意義（P＞0.05），而除此之外的其他細胞因子差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 疾病組與對照組細胞因子表達水平比較[M（M25，M75），pg/mL]

3 討論

流感病毒主要通過空氣中的飛沫、易感者與感染者之間的接觸或與被污染物品的接觸進行傳播，一般秋冬季節是高發期。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。人群普遍易感，潛伏期長短取決于侵入的病毒量和機體的免疫狀態，發病率高，病死率低，多以淋巴細胞和單核細胞浸潤為主[8-9]，這與該研究結果兩組單核及淋巴細胞對比差異有統計學意義的結果相一致。

該研究中，兩組CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞亞群之間差異無統計學意義（P＞0.05），疾病組各淋巴細胞亞群計數略低于對照組,提示機體抗病毒能力的下降，但流感病毒感染后，病毒感染進展過程中存在適應性免疫受損，T細胞亞群能通過相互影響、相互調節、相互制約保持動態平衡，這可能與非重癥有關[10]。CD3、CD4、CD8是T細胞受體識別外來抗原的輔助分子,表達這些分子的淋巴細胞是抗病毒免疫的重要組成部分,這些細胞數量的減少提示CD3、CD4、CD8是常見的T淋巴細胞表面標志物。CD3+CD4+細胞亞群能分泌細胞因子增強吞噬細胞的抗感染機制和直接誘導靶細胞凋亡，對細胞免疫起正調節作用；CD3+CD8+細胞亞群主要為抑制性T細胞，抑制機體免疫應答，也對靶細胞具有一定殺傷作用，對細胞免疫起負調節作用。當不同的T淋巴細胞亞群在數量上和功能上發生異常時，即可導致機體免疫功能紊亂。

疾病組NKG2D表達水平與對照組相比呈下調趨勢[(54.345±24.593）vs（69.398±13.003）]，這符合流感病毒逃避NK細胞的殺傷效應[11]。患者發生流感感染后，固有和適應性免疫細胞均參與介導宿主對病毒感染的免疫反應[12]。自然殺傷細胞（NK）是固有免疫系統的主要效應細胞，能有效地殺滅病毒感染的細胞，進而控制病毒感染。NK細胞作用于流感病毒的同時，有研究證明了流感病毒也具有反擊機制，主要通過直接誘導NK細胞凋亡、通過抑制性受體抑制NK細胞活化、抑制NK細胞產生TNF-α等不同的機制作用于NK細胞，影響NK細胞發揮殺傷功能，形成有效感染[13]。CD16+CD56+是NK細胞的表面標志，與T細胞淋巴亞群相似，可能由于NK細胞的殺傷和免疫逃逸作用[14]，兩組數據CD16+CD56+淋巴細胞水平之間差異無統計學意義。NKG2D是NK細胞表面重要的活化性受體，與配體結合后可激活NK細胞和CD8+效應細胞，產生抗病毒干擾素IFN-γ發揮細胞毒性作用，殺死被流感病毒感染的上皮細胞[15]。NKG2D還可作為協同刺激因子傳遞第二信號，增強其他活化性受體對NK細胞的激活作用[16]。

T淋巴細胞可以誘導分化為Th1，Th2，Th17，分泌產生不同的細胞因子，Th1產生IL-2、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ，促進細胞介導的免疫反應；Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α，誘導B細胞的活化和分化；Th17產生IL-17及TNF-α，免疫功能的紊亂勢必影響細胞因子表達水平的改變。流感病毒感染人體后,可以誘發細胞因子風暴,導致全身炎癥反應[17]。該研究結果顯示，疾病組與對照組相比，除IL-17及TNF-α差異無統計學意義之外，其他細胞因子水平差異有統計學意義。該研究中IL-17檢測差異無統計學意義，但在既往研究中IL-17對甲型與非甲型流感病毒感染相關肺炎患者具有較高的診斷靈敏度和特異性[18]，但在臨床感染中通常存在甲流乙流的混合感染，故單獨檢測IL-17意義不大。流感病毒感染時血清中IL-8明顯低于正常對照組，可能跟IL-8水平的變化能夠敏感地反映病情嚴重程度有關[19]。

該研究中，疾病組IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12P70及IFN-α、IFN-γ水平則明顯高于對照組（P＜0.05），這與楊艷娥等[20]研究結果相符。在其研究中分析呼吸道感染的熱性驚厥患兒IL-6、IL-10水平表達，結果顯示感染組患兒IL-6水平（27.70±8.74）ng/L及IL-10（2.15±0.55）ng/L顯著高于健康對照組患兒（4.46±1.10）ng/L、（6.37±1.76）ng/L（P＜0.001）。于濤等[21]在其研究中對呼吸道感染患者進行炎性細胞因子分析發現呼吸道病毒感染組TNF-α為（39.2±2.5）顯著高于無感染對照組（16.6±2.3）（P＜0.001）。IL-4、IL-5是Th2細胞分泌的特異性細胞因子，兩者都能夠刺激嗜酸性粒細胞活化、增殖、分化、移行，進而分泌多種炎癥介質參與炎癥反應[22]。TNF-α主要由巨噬細胞及活化的單核細胞分泌，為炎癥反應的始動因子，是機體損傷期間宿主反應最早、最強的介質之一，在重癥炎癥反應中高表達，同時亦可對機體免疫功能產生抑制作用[23]。章海峻等[9]的研究顯示甲型/乙型流感患者血清IL-2、IL-6、IL-10水平明顯高于對照組（H=10.43、6.78、114.26、67.43，P＜0.05）；同樣的結果在其他研究中也有報導，王海等[24]研究顯示流感病毒感染后,外周血中IL-12上升，其研究中流感組的IL-12水平高達（134.2±42.8）ng/L，顯著高于健康對照組（96.2±36.9）ng/L（P＜0.05）。IL-6是機體應激反應中最敏感、最重要的一種標志物，T細胞、B細胞及活化的單核細胞都能在不同條件下產生IL-6，具有促進和抑制炎癥反應的免疫代償作用，對維持機體穩態有重要作用[25]。IL-6是目前臨床運用較廣泛的炎癥指標，檢測便捷。血清IL-6水平和流感嚴重程度之間有著緊密的關系，同時也會影響到患者的預后[26]，因此如何在短時間內改善IL-6水平是臨床重要的治療方向[27]。該研究顯示，流感患者血清TNF-α水平與對照組差異無統計學意義，分析原因可能與流感產生的炎癥反應較輕有關。

綜上所述，流感患者外周血淋巴細胞上NKG2D表達水平降低，IL-8水平低于對照組，IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12P70及IFN-α、IFN-γ水平則明顯高于對照組，這對患者機體免疫功能的狀態、病情評估有一定臨床價值，可以作為診斷及監測疾病進展的有效指標，為流感的預防、診斷及治療提供一定的幫助。該文闡明了疾病發生后不同細胞亞群之間的相關性，為流感感染的診斷、治療和新型疫苗的研究提供理論依據和技術支持。