人參皂苷Rh2誘導肝癌細胞Hep G2自噬與凋亡的分子機制研究

高涵，吳琦，陳宏月，郭紅艷，周濤，劉哲丞

1.齊齊哈爾醫學院生物化學與分子生物學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161041

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡稱肝癌，是目前臨床上最常見的癌癥之一[1]。肝癌嚴重威脅人類的健康，其發病率和病死率也在不斷增加，在全世界，每年肝癌的新發病率居惡性腫瘤中的第5位，病死率居第3位。因此，植物的抗癌成分越來越受到人們的極大關注。人參皂苷（ginsenoside）是人參的主要活性成分之一，在癌癥的預防和治療中被極度重視和廣泛研究，然而人參皂苷對癌癥的作用機制是十分復雜的[2]。人參皂苷Rh2包括20(S)和20(R)兩種構型，20（S）-人參皂苷Rh2比20（R）-人參皂苷Rh2更具有顯著的抗癌作用，能夠抑制細胞增殖并且引起人肝癌HepG2細胞G1期阻滯[3]。20（R）和20（S）人參皂苷Rh2都具有抗癌作用[4],并且使得caspase-3活性增強，誘導肝癌HepG2細胞凋亡。目前，肝癌的病因及發病機制尚未完全闡明，但從腫瘤細胞學來看，肝癌發生的本質在于細胞增殖與凋亡的調節失控[5]。近年來中藥的抗癌機制研究取得了很大進展，尤其對肝癌細胞增殖周期的調控與誘導細胞凋亡兩方面內容[6]。該研究旨在觀察人參皂苷Rh2與肝癌細胞的自噬和凋亡，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

肝癌HepG2細胞由哈爾濱醫科大學生物化學與分子生物學實驗中心饋贈。20（S）-人參皂苷Rh2由齊齊哈爾醫學院分子生物學實驗室分離制備。胎牛血清的DMEM培養液（Hyclone公司，美國）、粉（Gibco公司，美國），0.25%EDTA（吉諾生物醫藥技術有限公司）。兔抗鼠caspase-8/9、beclin-1、LC3（Santa Cruz公司）。Cy3熒光抗體、FITC抗體（康威試劑公司）。倒置熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 細胞培養

使用含10%胎牛血清、丙酮酸鈉（20 000 U/L）、谷氨酰胺（20 000 U/L）、青霉素（200 000 U/L）和鏈霉素（0.02 g/L）的培養液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱內培養肝癌HepG2細胞，隔天換液，用胰蛋白酶消化后進行傳代。

1.3 免疫熒光實驗

用不同濃度的20（S）-人參皂苷Rh2作用于肝癌HepG2細胞后，HepG2細胞用95%乙醇室溫下固定10 min，使用PBS清洗3次。加入1 mL的0.1%TritonX-100于培養皿中，室溫下處理10 min，PBS清洗3次。將1 mL的1%BSA加入培養皿，37°C封閉1 h。將兔抗鼠caspase-8/9和beclin-1、LC3蛋白抗體按照1:200稀釋滴加在樣品上，放入4°C冰箱過夜。加入熒光Cy3或FITC標記的二抗，4°C冰箱過夜。加入DAPI染色液（1:500稀釋）室溫孵育5 min，用PBS清洗。通過熒光顯微鏡（Olympu）觀察HepG2細胞并拍照。每個實驗至少重復3次。

2 結果

為了進一步證實20（S）-人參皂苷Rh2對自噬相關基因Beclin-1和LC3表達的影響，以及caspase-8介導的膜受體途徑和caspase-9介導的線粒體途徑，從而誘導HepG2細胞凋亡的作用機制，將20μg/mL的20（S）-人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞，作用不同時間，分別用caspase-8/9抗體、自噬相關基因Beclin-1和LC3抗體，做雙染色免疫熒光分析。熒光Cy3標記caspase-8/9抗體，二抗對應一抗；熒光FITC標記LC3和Beclin-1抗體，二抗對應一抗。

20（S）-人參皂苷Rh2作用HepG2細胞3 h后，HepG2細胞caspase-8的活性和Beclin-1的熒光強度表達水平顯著升高。見圖1。

圖1 20（S）-人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞3 h caspase-8活性與Beclin-1表達的關系(×200)

20（S）-人參皂苷Rh2作用HepG2細胞3 h后，HepG2細胞caspase-9的活性和LC3的熒光強度增強，且兩者相近，說明caspase-9活性和LC3表達無顯著變化。見圖2。

圖2 20（S）-人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞3 h caspase-9活性與LC3表達的關系(×200)

3 討論

腫瘤的發生和發展是一個復雜的過程，涉及多因素、多基因的變化，多階段、多步驟的演變[7]。迄今為止，肝癌的病因和發病機制尚未充分闡明。從腫瘤細胞學來看，腫瘤的發生不僅與加速度腫瘤細胞增殖有關，而且與抑制腫瘤細胞死亡密切相關[8]。經過100多年的研究，人們將細胞的死亡方式分為兩類：非程序性細胞死亡和程序性細胞死亡 （programmed cell death，PCD）。非程序性細胞死亡稱為壞死（necrosis），它是細胞被動死亡的過程，在大多數情況下不受細胞信號轉導的控制[9]。程序性細胞死亡不同于壞死，壞死主要由細胞內基因組的調節，其最重要的形態學特征是細胞膜和核膜的完整性。目前，研究表明，程序性細胞死亡（PCD）包括細胞凋亡和自噬性細胞死亡兩類，自噬引起的細胞死亡稱為Ⅱ型PCD，凋亡稱為Ⅰ型PCD[10]。

促進腫瘤細胞死亡是治療腫瘤的方法之一。隨著自噬研究的深入，自噬在腫瘤發生、發展和消亡中的作用越來越受到關注[11]。在抗癌藥物的基礎研究和臨床應用中充分認識并合理利用腫瘤的自噬、凋亡和溶酶體陽性因子，調整腫瘤細胞自身的死亡機制[12]，有助于彌補甚至突破現有抗腫瘤藥物的缺陷和不足，促進腫瘤研究及其相關學科的共同發展。

腫瘤是最早發現的與自噬有關的疾病之一[13]，自噬的異常調節與腫瘤的發生發展有關。目前，參與自噬調控的基因被命名為自噬相關基因（autophagy related gene，ATG），進化比較保守[14]。自噬過程的調控機制非常復雜，至今尚未完全闡明。Beclin-1和LC3是自噬相關蛋白編碼的基因。目前關于自噬與腫瘤關系的研究已引起人們廣泛關注，但關于自噬與肝癌的報道卻很少。熊燚[15]研究顯示在其通路中細胞色素C從線粒體釋放到細胞漿中與胱天蛋白酶-9（caspase-9）結合形成凋亡體，激活caspase-9后進一步激活caspase-3，進而誘導細胞凋亡。還有報道，人參皂苷Rh2通過上調肝癌細胞SK-Hep-1中促凋亡蛋白激酶（PKC）活性可有效促進細胞色素C從線粒體釋放并且激活caspase-3，促進線粒體信號轉導，從而促進肝癌細胞凋亡[15]。研究發現,抗癌藥物可以激活JNK通路，通過激活上游腫瘤細胞自噬轉錄因子c-Jun和Beclin-1蛋白表達水平[16]。

生物學發展研究證實，凋亡作為調控機制在多細胞生物的正常發育中起著重要的作用。病理學研究顯示，細胞凋亡是許多疾病的基礎，細胞凋亡和逃逸是腫瘤發生和發展的重要機制之一。細胞凋亡是由基因控制的細胞活動，誘導腫瘤細胞凋亡是一種重要機制。caspase是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶，以酶原的形式存在于細胞質中，經兩次切割后被激活，細胞凋亡依賴于caspase的活化。caspase根據不同的分子結構和功能可分為：caspase-l/4/5/13/14，主要參與炎癥反應；caspase-2/8/10，參與caspase級聯反應的啟動過程；caspase-3/6/7，是凋亡的直接執行者。蛋白酶家族中與凋亡相關的酶主要是caspase-8、caspase-9和caspase-3等，它們的激活主要是通過膜受體途徑和線粒體途徑介導[17]。

該研究旨在進一步探討肝癌的發生、發展及人參皂苷Rh2是否通過調節自噬相關基因Beclin-1和LC3的表達而誘導凋亡，將20μg/mL人參皂苷Rh2作用于HepG2細胞不同的時間，然后進行免疫熒光分析。研究結果顯示，與對照組HepG2細胞相比，20（S）-人參皂苷Rh2作用組Beclin-1在1～4 h內明顯升高（P＜0.05），但LC3在各時間點的表達無明顯變化（P＞0.05）。通過免疫熒光分析，人參皂苷Rh2作用3 h后，caspase-8活性明顯升高，Beclin-1表達水平明顯增強，熒光標記的LC3表達無明顯變化。以上實驗證實，人參皂苷Rh2誘導HepG2細胞凋亡的作用主要通過膜受體途徑調節caspase-8實現，或可能與Beclin-1的表達有關，其作用有時間依賴性。然而，通過電子顯微鏡觀察結果，只有典型的細胞凋亡的特點，在第一、二期有典型急性左心衰合并肺感染診斷標準的凋亡小體；在第三、四期自噬過程中形成的凋亡體和吞噬體未見。因此，人參皂苷Rh2誘導HepG2細胞凋亡的作用是否與自噬有關，還有待進一步的實驗和研究。