lncRNA ihha-as在斑馬魚早期胚胎發育中的功能研究

歐陽奇，李小燈，遠長悅，李婧琳，韓 梅，胡 翔

(湖南師范大學生命科學學院，省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，中國 長沙 410081)

lncRNA是指生物體內長度大于200 nt且不具有編碼作用的一類長鏈非編碼RNA[1]。雖然大多數lncRNA不具備編碼蛋白的功能，但是在生命活動中起著至關重要的作用。有研究表明lncRNA參與了X染色體失活[2]、染色體修飾[3]、轉錄激活和干擾[4]；此外還與生物體的生長發育、代謝與分化、腫瘤產生之間有著密切聯系。

斑馬魚為硬骨魚，主要在印度東部、孟加拉國、巴基斯坦和緬甸水域中生活，因魚體兩側條紋類似斑馬而得此名[5]。斑馬魚不僅具有個體小、胚胎透明、體外受精、生長和發育周期短、單次產卵數較高、便于體外觀察和實驗等優勢外，更重要的是斑馬魚的組織和器官與人體極為相似，且斑馬魚的基因與人類的相似度高達87%。此外成年斑馬魚的心臟具有可再生功能，因此斑馬魚成為研究脊椎動物心臟再生模型的首選模式生物之一[6]。

心血管系統的發生包括心臟血管的形成以及血細胞的產生[7]。心臟作為胚胎發育中第一個形成的功能性器官，為血液循環提供持續動力，以滿足機體在生長發育過程中對循環和代謝的需求。心臟發育幾個重要過程分別是心臟前體細胞分裂分化、心管形成、心臟環化、心腔分隔，最終形成高度功能化的組織器官[8，9]。如今心血管和心臟發育引起的疾病較多，已經嚴重危害到人類生命健康[10，11]。在心臟發育中lncRNA有著不可替代的作用。

Ihha-as是存在于基因ihha附近的一條反義lncRNA，而基因ihha已經被報道與斑馬魚多處發育有關[12，13]，但是ihha-as在斑馬魚早期發育中的表達及功能研究至今沒有，在心臟發育過程中的作用目前也無文獻報道。本研究以斑馬魚為實驗材料，通過半定量和定量分析、整體原位雜交實驗、morpholino敲低和挽救等實驗來研究ihha-as在斑馬魚胚胎早期發育中的功能，探討其在斑馬魚心臟發育中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 Tu系斑馬魚 購買于中國科學院武漢水生生物研究所。

1.1.2 Morpholino 根據lncRNA ihha-as序列特征，由美國Gene Tools(https://www.gene-tools.com/)公司合成，序列為：GCCGA ACTAC AACCC GGACA TCATC。

1.1.3 試劑 DIG Mix、DIG-AP 抗體、Blocking Reagent(Roche公司)；20×PBS、多聚甲醛、甲基纖維素、甲酰胺、蛋白酶K(上海生工公司)；肝素(Aladdin公司)；tRNA和Trizol(Invitrogen公司)；胰酶粉末(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 根據NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、ZFLNC(http://www.zflnc.org/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu/)、NONCODE(http://www.noncode.org/)等數據庫對ihha-as進行序列分析。

1.2.2 熒光定量PCR 按照TaKaRa公司SYBR試劑說明書進行qPCR來檢測相關基因的表達情況，引物序列見表1。

表1 特異性引物序列Tab. 1 Specific primer sequence

1.2.3 Ihha-as重組質粒構建 按酶切體系，37 ℃ 1 h，再進行產物膠回收；按連接體系，將酶切后的膠回收產物按照一定比例混合均勻后，置于22 ℃條件下進行DNA連接反應1.5～2.5 h；再進行轉化，在長了菌落的培養皿中挑選單菌落，小搖2～3 h后，進行菌液常規PCR來篩選陽性結果，然后進行質粒測序，確定是否構建成功。

1.2.4 體外轉錄 選擇HindⅢ將質粒進行線性化后合成反義探針，然后再將其進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗；用DNA膠回收試劑盒將線性化質粒回收；將2 μL線性化產物與2 μL DIG-Mix/dNTP、2 μL T7 RNA聚合酶、4 μL 5×Transcript buffer、1 μL Ribolock Rnase Inhibitor、9 μL RNase-free水混合均勻后，于37 ℃體外轉錄2 h；在37 ℃下，加2 μL Dnase I除去模板DNA 20 min，即得到轉錄產物。

1.2.5 斑馬魚胚胎原位雜交

1)胚胎的收集與固定 收集不同發育時期的胚胎(24 hpf加入0.003% PTU減少黑色素的形成)，加入1 mL 4%多聚甲醛固定過夜(14 hpf之前的胚胎先固定后破膜，14 hpf之后的先破膜后固定)；胚胎固定好之后，棄去溶液。然后在室溫下，將固定好的胚胎置于搖床上，利用25%，50%，75%及100%甲醇依次進行洗脫，每次5 min；最終于管內加入1mL 100%甲醇于-20 ℃冰箱中保存。

2)原位雜交第一天 使用75%，50%及25%的甲醇梯度洗滌胚胎，每次5 min；再加1 mL PBST溶液，常溫下搖床處理4次，每次5 min；棄去PBST，將不同時期的胚胎加入稀釋后的蛋白酶K(10 mg·L-1)進行消化，吸去消化液，加1 mL PBST溶液，常溫下搖床處理2次，每次5 min；加入1 mL 4% PFA，搖床固定處理40 min；1 mL PBST洗5 min，共4次；加入預混液(500 μL PBST+500 μL HYB)，洗滌5 min；每管加入500 μL預熱好的HYB溶液，于65 ℃分子雜交爐中處理3～4 h；棄液，RNA探針以1 mg·L-1的濃度加入200 μL HYB溶液中，于65 ℃分子雜交爐中進行雜交，過夜。

3)原位雜交第二天 將RNA探針回收，保存于-80 ℃；加入1 mL 65 ℃的HYB，75%HYB，50%HYB及25%HYB溶液于管中，放入 65 ℃水浴鍋中依次洗滌，每次10 min，期間進行輕微搖晃；棄液，加入1 mL 65 ℃預熱好的2×SSC，65 ℃水浴鍋中處理2 min；棄液，加入1 mL 65 ℃預熱好的0.2×SSC，65 ℃水浴鍋中處理15 min，處理3次；棄液，加入1 mL MABT，75%MABT，50%MABT及25%MABT室溫下搖床依次處理5 min；棄液，加入800 μL阻斷溶液，室溫下搖床處理3～4 h；棄去阻斷溶液，加入1 mL稀釋抗體(V(地高辛抗體)∶V(阻斷溶液)=1∶5 000)，4 ℃搖床過夜。

4)原位雜交第三天 棄去地高辛抗體的阻斷試劑，加入800 μL 1%小牛血清的MABT試劑，常溫下搖床處理10 min；棄液，加入800 μL MABT試劑，常溫下洗8次，每次15 min；棄去MABT溶液，加入500 μL BCL Buffer，室溫下搖床洗3次，每次5 min；棄去BCL Buffer，將BM Purple AP Substrate與BCL Buffer按體積比1∶1配成染色液，每管加500 μL染色液，4 ℃下搖床進行，且本步驟用錫箔紙避光；染色結束后，加入1 mL PBST終止顯色反應；加入1 mL PBS溶液將其漂洗3次，并在體式顯微鏡下觀察原位雜交結果，對每個胚胎及時進行圖像采集。

2 結果

2.1 Ihha-as生物信息學分析

根據NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、ZFLNC(http://www.zflnc.org/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu/)及NONCODE(http://www.noncode.org/)等數據庫以及相關文獻分析發現，ihha-as是由斑馬魚9號染色體(小鼠5號，人類7號)產生的一個大約1 666 bp的單外顯子反義lncRNA。在NCBI上進行blast序列比對，發現斑馬魚與小鼠和人之間具有一個長度大約為240 bp的高度相似序列(如圖1A)；另外在UCSC上將斑馬魚與青鳉、刺魚、河豚、熱帶爪蟾、小鼠及人類7種生物基因組進行比較，結果顯示，在ihha-as100～400 bp附近該7種生物基因組具有極高的保守性(如圖1B)，預測該區域為ihha-as的功能區，對斑馬魚早期胚胎發育至關重要。

圖1 Ihha-as生物信息學分析圖Fig. 1 Bioinformatics analysis of ihha-as

2.2 Ihha-as時空表達

首先針對不同時期各挑選30枚正常發育、形態完整的斑馬魚胚胎進行固定，接著利用ihha-as的反義探針對固定好的胚胎進行整體原位雜交，檢測ihha-as的特異性表達情況。結果發現ihha-as在斑馬魚早期胚胎發育期間均有表達，尤其是在48 hpf和72 hpf時集中表達于斑馬魚心臟、頭部和脊索(如圖2A)。然后以斑馬魚成魚不同組織器官的cDNA為模板，β-actin作為對照，進行半定量PCR和qPCR。結果發現ihha-as在心臟中的表達較高，而在肌肉、腸和卵巢中較低，在其他組織中表達量無明顯差異(如圖2B,C)，這表明ihha-as對斑馬魚心臟發育至關重要，且檢測到的時空表達結果與生物信息學預測結果基本一致，因此可說明lncRNA ihha-as對斑馬魚心臟發育有著重要的意義。

圖2 Ihha-as時空表達圖(n=30)Fig. 2 Ihha-as spatiotemporal expression (n=30)

2.3 Ihha-as-morpholino敲低和挽救對斑馬魚胚胎發育的影響

挑選受精5 min后、發育完整的斑馬魚胚胎進行顯微注射，每一個組別各注射200枚胚胎。注射control-morpholino，ihha-as-morpholino敲低和ihha-as挽救后，ihha-as-morpholino注射組與對照組相比死亡率與畸形率都大大提高，而將morpholino與ihha-as共注射進行挽救時，筆者發現死亡率和畸形率大大降低，正常率明顯提高(如圖3A)，表明其對斑馬魚早期胚胎發育至關重要。同時與control-morpholino組相比，ihha-as注射組的胚胎出現發育遲緩，心包水腫，心臟靜脈竇出血，心率加快，尾部骨骼彎曲，色素沉著減少等缺陷，將ihha-as與morpholino共注射挽救時，發現該癥狀明顯緩解，心包水腫與心臟出血明顯降低，畸形率大大減少(如圖3B)。

圖3 Ihha-as-morpholino敲低和ihha-as挽救后表型結果圖Fig. 3 Phenotypic results after the ihha-as-morpholino knockdown and ihha-as rescue

2.4 Ihha-as-morpholino敲低和挽救對心臟發育的影響

為了更好地探究ihha-as在斑馬魚早期心臟發育中的作用，筆者收集顯微注射后48 hpf斑馬魚胚胎，每組各30枚，固定處理好后，選擇心臟標記基因amhc，vmhc和cmlc2作為探針，進行斑馬魚整體胚胎原位雜交。結果顯示：cmlc2組中ihha-as-morpholino敲低后，心臟未發生環化，呈線性狀，心臟發育遲緩，挽救后心臟線性化有所緩解，心臟形態清晰；amhc組中ihha-as-morpholino敲低后，amhc表達范圍變小，染色變淺，說明心房發育缺陷，挽救后心房表達區域變大，染色加深，心房結構有所恢復；vmhc組中ihha-as-morpholino敲低后，vmhc表達范圍變小，染色變深，說明心室發育遲緩，同時流出道染色不明顯，說明流出道發育有缺陷，挽救后心室形態結構完整，心室功能得到恢復(如圖4)。

圖4 Ihha-as-morpholino敲低和ihha-as挽救后心臟標記基因原位雜交圖(n=30)Fig. 4 In situ hybridization of heart marker genes after the ihha-as-morpholino knockdown and ihha-as rescue(n=30)

3 討論

在脊椎動物發育過程中心血管系統是最先形成并行使功能的系統之一，心臟作為該系統的主要器官之一，其作用就是進行血液循環。心臟發育過程中受到眾多基因及信號通路的調控，且受到一定遺傳因素的影響。在心臟前體細胞分化形成之后，就會發生細胞融合進而形成一個管狀器官——心管。心管在經歷一系列的形態變化后會形成具有一定形狀的房室結構和具有一定角度的成熟心臟，這一過程稱之為心臟環化[14]。心臟環化的機制較為復雜，TGF-β家族、nkx2及nodal等均與心臟的正確環化有關[15]。心臟正確環化能保證斑馬魚早期胚胎中正常的血液運輸，且為其生長發育提供一定的動力。若心臟未正確環化會產生心包水腫、心房心室形態過大或過小等問題，從而嚴重影響心臟形態和泵血功能[16]。

lncRNA作為近年來生物學的一個研究熱點，對其報道很多。在眾多的長鏈非編碼RNA中，發現大量與腦和眼睛等神經系統、骨骼和肌肉等運動系統發育相關的lncRNA[17]，但與心臟發育相關的lncRNA報道相對較少。曾有研究表明lncRNA uc.4的過表達直接影響斑馬魚的胚胎發育從而致使心臟畸形。該lncRNA通過調控心臟的相關表達基因，從而參與心肌發育、心臟神經細胞的分化等心臟發育過程[18]。本課題組通過生物信息學分析篩選了幾條具有高度保守性且與心臟發育相關的lncRNA，ihha-as就是其中一條具有特異性表達的lncRNA。ihha是Hedgehog信號通路中的一個信號分子，研究發現Hedgehog信號通路在胚胎發育、細胞的增殖分化和組織形成中起關鍵性的作用[19-21]。ihha作為Hedgehog信號通路中的一員，已經被報道與斑馬魚多種組織器官發育有關，如骨骼發育、食道形成，但是其反義lncRNA ihha-as在斑馬魚心臟發育形成過程中所起的作用至今無人研究。

目前許多靶基因在組織器官中的表達情況只進行了生物信息學預測，沒有在個體水平上進行準確的時空表達定位，這樣導致實驗結果不具備說服力。本研究以斑馬魚為模式生物，利用半定量PCR和qPCR、原位雜交等多種實驗方法確定了ihha-as在斑馬魚中的時空表達。結果顯示：時空表達結果與生物信息學分析預測高度吻合，在早期胚胎發育過程中，ihha-as在心臟中出現特異性表達，說明ihha-as對于早期胚胎的心臟發育至關重要。通過morpholino干擾ihha-as的表達，導致斑馬魚的胚胎出現了心包水腫、心臟靜脈竇出血等形態及功能上的變化，而這些變化都直接阻礙血液進入心臟[22]。

RNA干擾是利用反義RNA與正義RNA結合形成雙鏈RNA來特異性抑制目的基因表達的現象，通過人為的引入與目的基因序列一模一樣的雙鏈RNA，誘導內源性mRNA降解，阻止基因表達。因此RNA干擾也被認為是一種高效的抑制特定基因表達的干擾方法。但是研究發現，在斑馬魚中利用RNA干擾，其效果不穩定。而morpholino干擾卻能夠輕松解決這一問題。因此為了敲低ihha-as的表達，研究ihha-as的功能，本實驗利用morpholino干擾了ihha-as的表達，ihha-as-morpholino敲低后，斑馬魚心臟發育異常，挽救后斑馬魚畸形癥狀有所改善。

綜上所述，本研究運用生物信息學、半定量PCR及qPCR、整體原位雜交、morpholino干擾等多種實驗技術檢測了ihha-as的時空表達、過表達情況、敲低和挽救后表達情況，證明ihha-as在斑馬魚早期胚胎和心臟發育中具有至關重要的作用。