PM 2.5對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨密度和生物力學性能的影響

倪清麗 黃惠娟 林妹珠 董怡君劉宗玉 蔡芬 張小蕊

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院婦產科, 福建 福州 350025 2.廈門大學附屬附屬東方醫院, 福建 福州 350025 3.福建醫科大學福總臨床醫學院, 福建 福州 350025

絕經后骨質疏松癥 (postmenopausal osteoporosis, PMOP)指女性衰老相關性低雌激素效應導致高效骨重塑向骨吸收方向進行致骨脆性增加、骨顯微結構改變的一種全身骨代謝性疾病[1]。該病發病率逐年增加[2], 容易導致老年女性群體胸腰椎等部位骨折[3],骨折引發的高致殘率和高致死率給社會和家庭帶來了巨大的醫療和經濟負擔[4]。大氣細顆粒物PM 2.5 (particulate matter 2.5)是指大氣中空氣動力學直徑≤2.5 μm的固體和液體顆粒物的總稱，由于其粒徑小，比表面積大，幾乎可隨呼吸深達肺泡并沉積，進而進入血液循環，引發多臟器損害。國內外流行病學研究[5-7]指出，PM 2.5與較低的骨密度(bone mineral density,BMD)存在關聯。本研究擬探討不同濃度的PM 2.5對去勢SD大鼠骨密度及骨生物力學特性的影響，為PM 2.5與絕經后女性骨質健康的關系提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：選取3周齡約50 g的SPF級雌性健康SD大鼠50只，實驗動物許可證號 [SCXK(滬)2017-0001]。在中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院比較醫學科分籠飼養, 自由進食、飲水。飼養環境：溫度18 ℃～25 ℃ , 相對濕度為40 %～70 %。將大鼠適應生長一周后隨機分為5組，每組10只，分為假手術組、模型對照組、PM 2.5低、中、高劑量組。

1.1.2主要儀器：Thermo Sciencce GUV-15-H-1 大流量采樣器；三點力學測量儀器(型號:INSTRON，中國科學院長春科新公司)；雙能X線骨密度儀(型號:HOLOGICDISCOVERYW,美國) 。

1.2 方法

1.2.1PM 2.5的收集及混懸液配置

1.2.1.1PM 2.5的采集及處理：自2019年7月-2020年8月，選取福建省環境監測站主樓八樓作為采樣點(PM 2.5來源主要為交通排放和生活污染)，采樣高度約為10 m，用 Thermo Sciencce GUV-15-H-1大流量采樣器采樣。PM 2.5采樣頭 G1200-41(美國 Thermo Sciencce公司)，流量為 1.13 m3/min，用石英纖維膜(英國Whatman 公司)采集大氣PM 2.5。為消除可能載帶的有機物，采樣前需將纖維濾膜至于馬沸爐中450 ℃焙燒5 h。收集本地區大氣PM 2.5樣本，每連續采樣24 h更換一次濾膜。將采有PM 2.5的濾膜放入密封袋，于-20 ℃避光保存。

1.2.1.2PM 2.5染毒液制備：將采有PM 2.5的濾膜裁剪成1 cm×1 cm大小，浸入含有超純水的燒杯中，將燒杯放置于超聲振蕩器器的水浴箱中，超聲4 ℃震蕩30 min×6次，8層無菌紗布過濾洗脫PM 2.5顆粒后低溫高速離心機離心30 min(12 000 r/min)，棄上清液后沉淀物質真空冷凍干燥12 h。冷凍干燥后水分完全揮發，瓶底的PM 2.5灰色粉末室溫稱重后加入無菌PBS配制成 2 μg/μL混懸染毒母液，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2PM 2.5暴露濃度的計算及其依據:低、中、高暴露劑量分別根據中華人民共和國環境空氣質量標準(GB3095-2012)一、二級標準 24 小時平均年濃度限值(35、75 μg/m3)，以及國際環保組織綠色和平發布的《2015 年度中國366座城市PM 2.5濃度排名》中PM 2.5年均濃度150 μg/m3進行計算。以 150 μg/m3(0.150 μg/L)為例：健康人通氣量以 6 L/min計，24 h的PM 2.5吸入量為 0.150 μg/L×6 L/min×60 min/h×24 h/d=1 296 μg/d；大鼠通氣量以73 mL/min(0.073 L/min)計，則24 h 的PM 2.5吸入量為 15.91 μg/d。參照吸入的PM 2.5 在氣道深部和肺的沉積率為68 %～70 %。以70 %計算，則實際每日暴露量為15.91 μg×70 %11.14 μg。同法可推算輕、中劑量分別為 2.6、5.57 μg。將3 d劑量一次滴注，低、中、高劑量組每次染毒為7.8 μg、16.5 μg、33.3 μg，即低、中、高劑量組每次染毒分別為3.9 μL、8.25 μL、16.65 μL(PM 2.5混懸母液濃度為2 μg/μL)。假手術組、模型對照組給予生理鹽水20 μL，PM 2.5低、中、高劑量組給予PM 2.5混懸液,實驗時間持續九個月。

1.2.3建立人工絕經模型：除假手術組外，其余組在氣管滴注的5個月后行去勢術: 全程嚴格按照無菌操作進行，去勢前禁食禁水8 h。在大鼠腹腔注射3 %戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg) ，注射約15～20 min即被麻醉。仰臥位固定、備皮、消毒鋪單后背側雙切口入路逐層切開皮膚→皮下筋膜→肌肉和腹膜→腹腔。用一針線將切口兩側肌肉連同腹膜固定，充分暴露操作視野，事先準備好一圈與切口大小相近套線放置于切口處，鑷子輕柔撥開脂肪層找到卵巢(呈粉紅色桑葚樣)，結扎卵巢與子宮結合部，切除卵巢。同法切除另一側卵巢。術后密切觀察大鼠切口情況，切口邊緣連續3 d注射青霉素G 20萬單位抗菌消毒。假手術組僅取卵巢旁1 cm3大小脂肪組織，余下處理同上。

1.2.4檢測指標

1.2.4.1BMD 測定：去勢后第2、4個月進行骨密度測定，具體步驟：術前禁食禁水8 h，用3 %戊巴比妥鈉溶液對大鼠進行腹腔麻醉，麻醉后鋪單,讓大鼠呈仰臥位，四肢自然放松狀態于骨密度儀檢查床上，最大程度伸展大鼠腰椎(L3～5)及右側股骨，使充分暴露于X線下，運用大鼠測量軟件掃描腰椎(L3～5)及右側股骨，測量骨密度數值。

1.2.4.2骨生物力學測定：使用三點力學生物儀器對分離的左股骨進行三點彎曲測試評估。持續滴注9個月處死大鼠后用高壓滅菌后的手術器械取出左側股骨，剔除周圍結締組織后放入生理鹽水當中浸泡2 h，浸泡結束取出后將股骨頭凹面向下，股骨頭頭端朝前的位置放在間距為 20 mm 的兩個支撐點上，最大加載速度 2 mm /min，啟動開關施加壓力，等待股骨斷裂后根據力儀器操作屏幕上自帶的軟件記錄載荷-位移曲線并分析數據，最后得出彈性模量、極限載荷、彈性載荷等骨生物力學指標。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 去勢大鼠一般情況

各組大鼠術后 3 d 活動較少，進食飲水量減少，考慮與術后切口疼痛有關。各組大鼠于術后第4天均可正常飲食 , 活動恢復正常。各組大鼠術后切口均愈合良好 , 無紅腫、皮溫高等表現, 無大鼠出現死亡 , 所有實驗大鼠于術后1周拆除縫線。

2.2 PM 2.5對去勢大鼠不同時間各組間腰椎(L3～5)、右側股骨BMD的影響

據7個月時測得的骨密度結果顯示 , 5組SD大鼠腰椎及右側股骨BMD比較差異無統計學意義 (P>0.05)。滴注9個月后，模型對照組及PM 2.5各劑量組腰椎及右側股骨 BMD 與本組去勢7個月時比較差異有統計學意義 (P<0.05)。滴注9個月后PM 2.5去勢組腰椎及右側股骨BMD低于假手術組及模型對照組,差異有統計學意義(P<0.05)，且PM 2.5各組間呈現一定的劑量關聯趨勢，中、高劑量組BMD降低趨勢明顯，同時模型對照組腰椎及右側股骨BMD明顯低于假手術組，差異有統計學意義 (P<0.01)，見表1。

表1 大鼠去勢后不同時間腰椎(L3～5)、右側股骨BMD 比較Table 1 Comparison of BMD of lumbar vertebrae (L3-5) and right femur at different time after ovariectomy in g/cm2)

2.3 PM2.5對去勢大鼠各組間左側股骨生物力學比較

三點彎曲實驗結果顯示：模型對照組、PM 2.5低劑量組股骨的彈性載荷、極限載荷、彈性模量與假手術組相比均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，PM 2.5劑量組的股骨彈性載荷、極限載荷和彈性模量降低(P<0. 05) ，下降趨勢與BMD一致，高劑量組下降最為顯著。見表2。

表2 PM 2.5對去勢9個月后大鼠左側各組間股骨生物力學比較

3 討論

PMOP 是臨床上常見的原發性骨質疏松癥的一種類型[8],是老年女性群體發生胸腰椎及腕部骨折的主要原因[2]。國內外流行病學調查[5-7]表明環境中的大氣細顆粒物(PM 2.5)暴露與骨密度(BMD)降低及 OP 的發病有關。因此，明確PM 2.5暴露對OP的影響，對引起人們對環境問題和絕經后女性骨骼健康的重視具有重要意義。

雙側卵巢切除大鼠模型已被廣泛應用于婦女絕經后骨質疏松癥的動物模型[9-10]，研究[11]發現大鼠去卵巢后, 在12周內即可發生骨質疏松。因此，課題組選擇對飼養5個月后的SD大鼠進行去勢手術，之后繼續對去卵巢SD大鼠進行PM 2.5氣管滴注3～4個月，以觀察PM 2.5是否會加重SD大鼠絕經后骨量減少。本實驗測定結果顯示，模型對照組與假手術組相比，腰椎、股骨的骨密度及骨生物力學均有顯著下降，證實OVX骨質疏松模型成功。

BMD 降低是骨質疏松時骨變化的重要特征,在目前眾多檢測BMD的方法中，DXA被公認為是診斷骨質疏松的金標準[12-13]。本實驗采用DXA對大鼠腰椎和股骨進行了檢測，測量結果表明，氣道滴注第9個月末時, 模型對照組及PM 2.5劑量組大鼠腰椎及右股骨 BMD 與本組7個月末時比較差異有統計學意義 (P<0.05)，這與大鼠的骨骼發育成熟期及皮質骨代謝周期一致。實驗進一步發現PM 2.5染毒可明顯降低去卵巢大鼠的骨密度,中、高劑量組的BMD明顯降低，而且骨損傷與PM 2.5劑量之間呈負相關，即隨著染毒劑量的增加，單位骨組織的骨礦含量下降，骨強度降低。由此可見，控制大氣污染，可能成為預防骨質疏松癥及其相關骨折的一項新措施。

生物力學特性綜合反映了骨結構連續性、骨量、骨皮質厚度以及骨的材料特性，從生物力學角度來看，骨脆性不僅僅由骨強度來定義，而是由生物力學中的彈性模量、脆性等眾多指標構成[14-15]。因此本實驗選擇彈性載荷、極限載荷、彈性模量具有代表性的三大指標來研究PM 2.5對去勢大鼠骨組織生物力學性能的影響。結果表明模型對照組、PM 2.5低劑量組的彈性載荷、極限載荷、彈性模量均低于假手術組，差異有統計學意義(P<0. 05)。與模型對照組比較，PM 2.5劑量組降低了股骨的彈性載荷、極限載荷和彈性模量(P<0. 05)，這說明PM 2.5加重了骨生物力學和結構力學性能的下降，減少骨組織的承載能力，降低骨骼抵抗外力沖擊的能力，從而加速去卵巢后引起的骨質疏松，增加骨折的發生。

PM 2.5 作為大氣污染中的主要污染物，由于粒徑小，比表面積大，易富集多環芳烴等特點，可隨著人的呼吸進入體內導致呼吸和心血管等系統疾病，其在骨代謝中的作用機制尚不完全清楚。長期暴露于PM 2.5 引起的氧化性損害和炎性反應，可能影響骨骼健康[16]。張寶玉等[17]的實驗結果表明PM 2.5可能是通過調節RANKL/OPG 信號通路的表達，誘導產生更多破骨細胞，影響骨代謝，最終引起骨量減少甚至導致骨質疏松癥。PM 2.5中的PAHs、重金屬、多氯化聯苯同源物等成分可誘發癌變，腫瘤細胞可以通過刺激破骨細胞增殖，加速骨丟失，從而引起骨質疏松癥[18]。因此后續實驗將通過氧化損傷、OPG/RANKL/RANK信號通路、癌變作用等方面研究PM 2.5暴露如何加速PMOP的發展。

綜上，PM 2.5會加劇去勢大鼠BMD及生物力學指標的下降，但確切的作用機制及信號通路尚無定論，值得進一步研究探討。