健骨顆粒抗去卵巢大鼠骨質疏松的血清代謝組學研究

劉文靜 楊娟 黃美雅,3 張楚天 孫攀 黃云梅,3*

1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122 2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122 3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是因機體雌激素水平下降，骨質流失增加，骨微結構破壞，易致骨折的一種代謝性疾病[1]。中醫理論認為絕經后骨質疏松癥的主要發病基礎是機體腎虧脾虛，故臨床上以補腎健脾、強筋壯骨為用藥原則。健骨顆粒是臨床常用經驗方，由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等中藥組成，具有補腎健脾、強筋壯骨之功效。前期實驗[2-5]表明健骨顆粒可通過降低miR-14及CylinD1等的表達促進成骨細胞分化，通過抑制RANKL等的表達從而抑制破骨細胞形成，發揮治療絕經后骨質疏松癥的作用。

代謝組學主要研究疾病、藥物效應或其他刺激反應所引起機體代謝物波動的詳細情況[6]。中藥方劑發揮作用通常是方劑中有效成分網絡對機體疾病狀態下生物分子網絡調節的綜合結果[7]，適合以“組學”的手段進一步開展系統性的研究。本文在前期健骨顆粒實驗基礎上通過對大鼠血清代謝組學研究，探討健骨顆粒對去卵巢骨質疏松大鼠的作用機理，以期為臨床防治絕經后骨質疏松癥提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材：健骨顆粒組方為煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、山藥、黨參等。原藥材購于福建省醫藥公司，由福建中醫藥研究院中試車間負責加工制備，每克健骨顆粒含原生藥2.9 g。

1.1.2儀器：Discovery Wi雙能X線骨密度儀(美國 Hologic公司)；IG-A1000 N萬能材料試驗機(日本島津儀器公司)；Q Exact質譜儀(美國Thermo Scientific公司)；UltiMate 3000高效液相系統(美國Thermo Scientific公司 )；HYPERSIL GOLD AQ色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo Scientific公司)。

1.1.3動物：60只3月齡SPF級雌性SD大鼠，質量(280±20)g，許可證號：SCXK(浙)2014-0001，購于浙江省實驗動物中心，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心鼠類實驗室，環境設施為SPF級，合格證號：SYXK(閩)2014-0005。在溫度 21 ℃、相對濕度 70 %～80 %、通風良好、自然光照的環境下，給予大鼠標準飼料飼養，自由進食、飲水、活動。

1.2 方法

1.2.1動物實驗及樣本采集：將60只雌性SD大鼠隨機分為正常組、模型組和健骨顆粒組，每組20只。模型組和健骨顆粒組經腹腔注射0.3 mL/100 g 的10%水合氯醛麻醉，摘除雙側卵巢，術后每只肌注8萬單位青霉素抗感染，正常組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織，其余操作同卵巢切除組。術后常規喂養一周后，健骨顆粒組大鼠按生藥5.8 g/(kg·d)給予健骨顆粒藥液，其余組給予等量生理鹽水灌胃。分別于第6 周、12 周各取材一半，取右側股骨、脛骨及第四腰椎進行骨密度及生物力學檢測，并隨機每組選4只大鼠取腹主動脈血分離血清。本次動物實驗經福建中醫藥大學動物倫理委員會批準，并遵守所有與動物倫理使用相關機構和政府的法規。

1.2.2骨密度檢測：將大鼠右側股骨放置在帶有小動物骨密度測定軟件的骨密度(bone mineral density, BMD)掃描儀探頭下檢測，經計算機自動分析得出大鼠右側股骨 BMD 相關數據。

1.2.3骨骼生物力學性能檢驗:將右側脛骨及第四腰椎去除周圍軟組織，分別運用三點抗彎法和壓縮法測定脛骨與腰椎的最大載荷。

1.2.4色譜及質譜檢測：正離子流動相：緩沖液 A=0.1 %甲酸、水、10 mmol/L 醋酸銨；緩沖液 B=0.1 %甲酸、水、90 %乙腈，10 mmol/L 醋酸銨。負離子流動相：緩沖液 A=5 %(v/v)乙腈-10 mmol/L 醋酸銨，pH 9；緩沖液 B=90 %(v/v)乙腈-10 mmol/L 醋酸銨，pH 9。梯度洗脫：0～1 min，100 % A，0 % B；9～12 min，0 % A，0 % B；12.1～15 min，100 % A，0 % B；流速0.35 mL/min。質量控制(quanlity contral，QC)樣品進行正離子掃描及負離子掃描(全掃描范圍m/z 70～1 050)，離子強度TOP15的母離子進行二級質譜鑒定。母離子使用HCD方法碎裂，進行二級質譜序列鑒定，獲得質譜檢測原始數據。

1.3 數據處理

通過Compound Discover(CD)軟件進行數據提取處理，基于QC樣品TIC圖疊加，查看LC-MS檢測系統的穩定性。通過mzCloud和綜合數據庫ChemSpider在線搜索鑒定化合物，Pathway Analysis數據庫檢索和確認差異代謝物，綜合單變量統計和多變量統計分析篩選具有潛在生物學意義的差異代謝物。樣品間歸一化處理及樣品代謝物間標準化處理后，采用正交偏最小二乘判別分析( OPLS-DA)制火山圖。t檢驗考察代謝物組間差異的顯著性，運用SPSS17.0對差異性代謝物取Log后進行單因素方差分析。通過差異代謝物的代謝通路和顯著差異代謝物富集分析篩選潛在的靶標路徑。

2 結果

2.1 骨密度檢測結果

大鼠右側股骨骨密度如表1所示，與正常組相比，同期模型組骨密度下降(P<0.01)；與模型組相比，同期健骨顆粒組大鼠骨密度均升高(12周，P<0.01)。

表1 股骨近端骨密度檢測結果Table 1 The test result of bone mineral density(g/cm2,

2.2 骨生物力學檢測結果

大鼠脛骨與腰椎的最大載荷結果如表2所示。與正常組相比，同期模型組骨組織生物力學最大載荷均下降(P<0.05或P<0.01)；與模型組比，同期健骨顆粒組大鼠脛骨及第四腰椎的最大載荷均升高(6周腰椎最大載荷P<0.05，12周均為P<0.01)。

表2 各組大鼠脛骨及第四腰椎最大載荷檢測結果

2.3 基于LC-MS/MS平臺的大鼠血清代謝組學檢測

QC樣品的穩定性試驗考察基于HPLC-MS/MS平臺正離子模式(positive ion mode，Pos)和負離子模式(negative ion mode，Neg)兩種電離方式同時檢測，大大提高代謝物覆蓋率。QC樣品TIC圖疊加顯示LC-MS系統穩定性結果如圖1，各血清樣品中的離子峰分離較明顯。

圖1 大鼠血清樣品TIC圖Fig.1 TIC picturefrom LC-MS/MS spectra of serum注：A：正離子模式；B：負離子模式。

2.4 分層聚類分析血液數據結果

分層聚類分析所得熱圖(圖2)直觀顯示出正負離子通道鑒定的所有血清代謝物在各組之間的含量變化趨勢。圖中水平軸和垂直軸分別代表樣品與變量信息，正常組與其他各組顯著分開。模型組與正常組組間差異提示去卵巢大鼠機體代謝發生變化；健骨顆粒組與模型組組間差異明顯，提示中藥對去卵巢大鼠的代謝有調節作用。

圖2 分層聚類對比分析各組大鼠血清內源性物質的相關性Fig.2 Clustering result of endogenous materials of rats serum metabolites shown as heatmap注：A、E：6周正常組/模型組；B、F: 6周模型組/健骨顆粒組；C、G:12周正常組/模型組；D、H: 12周模型組/健骨顆粒組；A～D為正離子模式；E～H為負離子模式；-正常組；-模型組；-健骨顆粒組；顏色深淺反映變量值大小，紅色：含量最高，綠色/藍色：含量最低。

2.5 絕經后骨質疏松大鼠機體代謝表型的變化

正常組、模型組及健骨顆粒組組間代謝物譜差異的OPLS-DA結果如圖3所示，正常組和模型組的血清樣本點在PCI維可以完全分離，且各樣本點在一定范圍內聚集較好，說明去卵巢后骨質疏松大鼠機體生理及物質代謝情況已經發生了明顯變化。采用 7 倍交叉驗證法驗證OPLS-DA模型可靠性，結果見表3。從生理代謝物的變化層面可認為本研究建立的模型成功，可靠性較高。

表3 OPLS-DA 模型的主要參數Table 3 Main parameters of the OPLS-DA model

圖3 大鼠血清OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots derived from LC-MS/MS spectra of serum注：A、E：6周正常組/模型組；B、F: 6周模型組/健骨顆粒組；C、G:12周正常組/模型組；D、H: 12周模型組/健骨顆粒組；A～D為正離子模式；E～H為負離子模式。

2.6 絕經后骨質疏松癥相關潛在生物標志物的鑒定及差異代謝物分析

本研究使用OPLS-DA模型中變量重要性投影(VIP)參數評價且經t檢驗篩選差異性代謝物，結果見圖4。經t檢驗篩選出27種差異代謝物作為潛在的生物標志物并進行單因素方差分析。研究發現，與正常組相比，模型組中脂質代謝及嘧啶代謝的相關代謝產物乙酰左旋肉堿、花生四稀酸、硬脂酸、膽汁酸、皮質酮及尿苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶等含量均下降，與模型組相比，健骨顆粒組其含量均上升；模型組中氨基酸代謝相關的纈氨酸及L-精氨酸的含量均上升，健骨顆粒組含量與模型組相比均下降(表4)。其中，16-羥基十六烷酸、硬脂酸、泛酸等組間對比差異顯著(P<0.05)，具體結果見圖5。

表4 歸一化處理血清與絕經后骨質疏松模型相關的生物標志物的信息Table 4 Normalized serum biomarker information related to postmenopausal osteoporosis model

圖4 差異代謝物篩選火山圖Fig.4 Volcano picture of DEM about potentially different metabolites注：A、E：6周正常組/模型組；B、F: 6周模型組/健骨顆粒組；C、G:12周正常組/模型組；D、H: 12周模型組/健骨顆粒組；A～D為正離子模式；E～H為負離子模式；紅色：顯著上調的代謝物；藍色：顯著下調的代謝物；黑色：閾值外的代謝物。

圖5 具有顯著差異性的代謝產物Fig.5 Metabolites with significant difference注：組間對比顯著差異性，*P<0.05；組間對比顯著差異性，#P<0.005。

2.7 血清中差異代謝物相關代謝通路分析

經路徑分析，結合“2.6”項結果對所富集的代謝通路篩選見表5。泛酸和輔酶A、初級膽汁酸、類固醇激素及不飽和脂肪酸的生物合成、嘧啶代謝和其他次生代謝產物的生物合成影響值大于0.10，提示OPLS-DA所篩選出的差異代謝物與這些代謝途徑密切相關，說明健骨顆粒發揮治療作用與這些代謝途徑有關。

表5 構建分析通路結果(Impact > 0.10)Table 5 Result from pathway analysis (Impact>0.10)

3 討論

卵巢切除術是經典的絕經后骨質疏松癥動物模型制作方法，結果顯示，本次實驗造模成功，藥物干預后骨密度與骨生物力學指標均有所改善，表明健骨顆粒對去卵巢后骨質疏松癥有治療作用。

絕經后體內雌激素水平下降，炎性因子濃度及氧化應激標志物均升高[8-9]。動物實驗表明，去卵巢后大鼠體內雌激素水平下降，從而引起代謝機制紊亂及內源性代謝物含量變化，尤其是體內脂代謝。此外，雌激素可減少膽汁酸排出[10-11]，緩解蛋白消耗，調節多種炎性疾病[12-15]。代謝組學研究[16-18]發現，去卵巢后骨質疏松大鼠體內雌激素水平下降，可引起脂代謝、核酸代謝及氨基酸代謝紊亂，導致肥胖、脂肪肝、骨質疏松等一系列疾病。中藥干預可調節大鼠機體的脂代謝、氨基酸代謝及核酸代謝等[19-20]，使機體恢復正常。本研究結果與文獻報道大體一致，去卵巢大鼠體內脂代謝、核酸代謝和氨基酸代謝異常，健骨顆粒干預后大鼠體內脂代謝、核酸代謝及氨基酸代謝得到調節，機體有恢復正常的趨勢，其中脂類代謝的變化尤其顯著。

脂類代謝包括脂肪酸代謝、初級膽汁酸合成、類固醇生物合成、花生四稀酸代謝、神經鞘磷脂的合成等。脂肪酸類具有抗炎功能[21-22]。膽汁酸可影響維生素D的腸道吸收，對成骨細胞有破壞作用,影響進鈣、磷吸收，新骨形成及舊骨溶解，致低骨密度及骨流失，引起膽汁淤積性骨質疏松癥[23-24]。與模型組相比，健骨顆粒組中這些代謝產物的含量有恢復正常的趨勢，但6周膽汁酸含量變化除外。推測其因卵巢切除后體內雌激素含量下降致膽汁酸代謝增強，所以模型組膽汁酸含量明顯升高。此外，乙酰左旋肉堿具有運輸脂肪的能力，與正常組相比，模型組中其含量下降，與模型組相比，健骨顆粒組含量上升，表明藥物干預可調節機體脂代謝。脂代謝相關物質的含量變化說明去卵巢骨質疏松大鼠機體脂代謝紊亂，健骨顆粒可通過改善脂代謝對絕經后骨質疏松起一定的干預調節作用。

本次篩選的相關代謝產物還有皮質酮、纈氨酸、泛酸、大豆苷元以及與核酸代謝相關的尿嘧啶、尿苷及胞嘧啶核苷。其中，皮質酮可誘導氧化應激，與花生四稀酸相互作用干擾正常生理行為[21]，致成骨細胞凋亡增加,分化能力減弱及雌激素護骨作用降低[8,25]。纈氨酸是人體必需氨基酸之一及生糖氨基酸。其缺乏會抑制嗜中性與嗜酸性白細胞增殖[26]，影響免疫功能及抑制炎癥調節功能。泛酸是脂肪酸合成類固醇所必需的物質，是合成輔酶A(CoA)的重要成分，CoA參與生物體內糖類、脂肪、蛋白質的代謝[27]。大豆苷元可促進人成骨樣細胞分化,使骨量增加,骨結構改善,可改善骨質疏松癥狀[28-29]。核酸類物質具有遺傳、介導和催化生化反應、提供或轉移能量等功能。其含量變化說明模型組機體核酸代謝及氨基酸代謝異常，而健骨顆粒可改善去卵巢后骨質疏松機體核酸代謝及氨基酸代謝。

綜上，基于LC-MS技術的代謝組學研究發現，去卵巢后大鼠體內脂代謝、嘧啶代謝及氨基酸代謝等紊亂，健骨顆粒干預可改善其代謝情況。因此，健骨顆粒可能通過調節多種代謝通路從而改善絕經后骨質疏松癥。