外周血游離線粒體DNA定量水平在結直腸癌患者預后判斷中的價值

龍文婧 呂翠翠

（1 沈陽市第一人民醫院檢驗科，遼寧 沈陽 110041；2 浙江大學附屬第一醫院檢驗科，浙江 杭州 310003）

我國結直腸癌屬于消化系統最常見的惡性腫瘤，其發病率、致殘率和致死率均較高，其中結直腸癌術后復發、遠處轉移等是引起患者臨床死亡的最主要原因[1]。線粒體脫氧核糖核酸（mtDNA）的突變將導致細胞線粒體氧化能力降低，被認為與惡性腫瘤的發生發展存在一定相關性[2]。結直腸癌患者體內線粒體為獨立于細胞核外且唯一具有DNA活性的代謝相關細胞器，在結直腸癌發生發展過程中發揮十分重要的作用[3-4]。以往研究證實，mtDNA拷貝數與結直腸癌預后存在一定相關性，其水平越高患者預后越理想[5]。另有學者認為，結直腸癌腫瘤組織中mtDNA拷貝數量與患者生存時間與生存率之間均存在正相關性[6]。為更好的闡明mtDNA水平與結直腸癌患者發病及預后之間的相關性，本研究針對結直腸癌mtDNA進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年2月至2019年9月本院收治的結直腸癌患者80例為研究對象，所有入組者診斷均通過病理組織活檢確診，入組前簽署入組同意書并申報醫院倫理委員會批準。納入標準：診斷明確、實施手術治療、未合并其他部位惡性腫瘤及線粒體相關疾病、臨床資料完整、預計生存時間超過6個月。排除標準：未實施病理組織活檢確診者；應用新輔助放化療治療者；合并其他部位惡性腫瘤者；存在線粒體相關疾病者；嚴重心、肺、肝、腎功能障礙者。年齡18～60歲，平均（53.60±2.90）歲，分化程度：低分化者23例，中分化者37例，高分化者20例，合并淋巴結轉移者40例，無淋巴結轉移者40例。

1.2 方法 留取入組者晨起空腹肘靜脈血5 mL，行EDTA-K2抗凝后離心5 min，留取上清液置于-80 ℃冰箱內保存待測，同時留取手術切取腫瘤組織、癌旁組織各25 mg，均置入液氮研磨器迅速研磨，提取基因組DNA，并留取入組者外周血200 μL血漿，按照血液基因組提取試劑盒說明書提取血漿基因組DNA，均以ND 5000超微紫外可見分光光度計定量。最后進行PCR檢測，通過Premier 5.0軟件設計引物，其中上游引物序列為5'-CCCACATTAGGCTTAAAAACAGAT-3'，下游引物序列為5'-TATACCCCCGGTCGTGTAGCGGT-3'。

1.3 觀察指標 比較不同分化程度（低分化、中分化及高分化）者線粒體mtDNA水平；比較不同部位（腫瘤組織、癌旁組織及正常組織）線粒體mtDNA水平；比較是否合并淋巴結轉移線粒體mtDNA水平。

1.4 統計學處理 使用SPSS 20.0進行數據處理，計量資料以（）表示，兩組間均數的比較使用t檢驗，多組間組內均數比較采用方差分析進行，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同分化程度者線粒體mtDNA水平比較 不同分化程度者線粒體mtDNA水平比較中低分化者低于中分化低者于高分化者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同分化程度者線粒體mtDNA水平比較（copy/μgDNA，）

表1 不同分化程度者線粒體mtDNA水平比較（copy/μgDNA，）

2.2 不同部位線粒體mtDNA水平比較 不同部位線粒體mtDNA水平比較中，腫瘤組織低于癌旁組織低于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同部位線粒體mtDNA水平比較（copy/μgDNA，）

表2 不同部位線粒體mtDNA水平比較（copy/μgDNA，）

2.3 是否合并淋巴結轉移線粒體mtDNA水平比較 合并淋巴結轉移者其線粒體mtDNA水平顯著低于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 是否合并淋巴結轉移線粒體mtDNA水平比較（copy/μgDNA，x-±s）

3 討 論

線粒體功能的缺陷被認為是惡性腫瘤發生發展的重要原因，尤其在實體惡性腫瘤患者中，能量代謝的紊亂引起線粒體DNA拷貝數量與氧化磷酸化相關酶活性的改變，進而導致mtDNA拷貝數調控失調[7]。相對于核基因組，mtDNA缺乏有效的損傷修復系統故更易發生癌變，是致癌物攻擊的最主要靶點之一[8]。mtDNA大片段甚至全基因組缺失，或mtDNA拷貝數量的改變在惡性腫瘤的發生發展、機體衰老的發生以及多種遺傳相關疾病的發生中均占據重要地位[9]。mtDNA缺失后其復制速度亦發生改變，被認為是導致線粒體功能障礙的重要原因[10]。

本研究發現，不同分化程度結直腸癌患者線粒體mtDNA水平表達上，低分化者低于中分化低者于高分化者，提示分化程度越差，mtDNA水平表達越低，考慮可能是因為惡性腫瘤細胞線粒體基因組聚合酶γ基因核苷酸變異引起線粒體mtDNA水平顯著降低，加重線粒體功能障礙有關[11-13]。另外針對不同部位線粒體mtDNA水平比較發現，腫瘤組織低于癌旁組織低于正常組織，證明腫瘤組織中線粒體mtDNA水平水平顯著降低，尤其低于正常組織。考慮可能與線粒體mtDNA活化鈣調磷酸酶依賴的線粒體核逆向信號通路，誘導細胞發生上皮間質樣改變，進而發生惡性腫瘤有關[14]。最后比較是否合并淋巴結轉移線粒體mtDNA水平發現，合并淋巴結轉移者其線粒體mtDNA水平顯著低于無淋巴結轉移者。考慮可能與合并淋巴結轉移的結直腸癌患者，PI3K/AKT/mTOR通路活性增強，進而激活腸上皮細胞出現凋亡抵抗，并增強其侵襲能力有關[15-16]。

綜上所述，線粒體mtDNA表達水平與結直腸癌分化水平、腫瘤侵犯部位及是否合并淋巴結轉移存在一定相關性，線粒體mtDNA表達水平越低，分化水平越低，存在淋巴結轉移可能性越高。