荊芥多糖制備及對百合荊梨汁的抑菌效果

曹 陽 張麗芳 賈春鳳

(1. 江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223003；2. 保定學院，河北 保定 070100)

荊芥(Schizonepeta)為唇形科[1]，是一種藥食同源的植物，具有鎮痛消炎、止血、去痰平喘、抗氧化等多項作用，主治咽喉腫痛、感冒發熱、多種皮膚疾病等，為中醫臨床常用藥物[2]，在食品中的應用鮮見報道。荊芥主要含有荊芥揮發油、薄荷酮、荊芥苷、黃酮、荊芥多糖等[3]，目前，荊芥揮發油是荊芥功能成分的主要研究對象[4-5]，對荊芥中多糖成分的研究較少。

近年來，天然抑菌劑的研發備受關注。資料[6-8]顯示，很多植物多糖具有較好的抑菌活性。孫立卿等[9]曾研究了荊芥多糖的提取工藝，發現荊芥中多糖質量分數可高達13.41%。有資料顯示，荊芥多糖不僅具有調節免疫功能的作用[10]，還具有一定的抗氧化功能[11]，具有較高的研發價值。但目前對荊芥多糖的抑菌功能未見相關報道。

試驗擬探究荊芥多糖的提取工藝，并將其與具有潤肺、消痰、止咳、降火、治風熱等功能的雪花梨[12-14]，以及具有潤肺止咳、美容養顏、寧心安神等功效的干百合花[15]按一定比例配置成飲品，考察荊芥多糖對此飲品的抑菌效果，以期為荊芥在食品中的應用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雪花梨：江蘇省淮安市市售；

干百合花：蕪湖四月茶儂茶葉有限公司(分裝)；

荊芥：江蘇省淮安市大藥房；

干檸檬片：蕪湖四月茶儂茶葉有限公司(分裝)；

單晶體冰糖：保定市大眾味業有限公司；

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉菌(P.notatum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：江蘇食品藥品職業技術學院微生物實驗室保存；

牛肉膏：天津市德晟生物技術有限公司；

蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

電子天平：JA2002型，上海精天電子儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：YX-24LDJ型，江陰濱江醫療設備有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2F型，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；

電熱恒溫培養箱：svp-01型，湖北省黃石市恒豐醫療器械有限公司；

可見分光光度計：722N型，上海棱光技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

(1)荊芥多糖制備：

荊芥→曬干→磨粉→稱量→加水→加熱→過濾→濾液→冷卻→多糖提取液

(2)百合荊梨汁制備：

1.2.2 原材料樣品制備

(1)雪梨汁：取新鮮雪花梨，清洗，去梗去核，切成1～2 cm的小塊，稱取100 g于1 000 mL白瓷缸中，加飲用水500 mL，加熱至沸騰后再用小火熬制至250 mL。

(2)檸檬汁：稱取干檸檬片15 g，加飲用水500 mL，加熱至沸騰后，改用小火熬煮濃縮至250 mL。

(3)糖水：稱取冰糖200 g，加水500 mL，加熱至沸騰后，改用小火熬煮8 min，冷卻至室溫，分裝于錐形瓶中，以4層保鮮膜及1層保鮮袋密封，放于冰箱冷藏備用(4 ℃)。

(4)百合雪梨汁：先按雪梨汁40%、糖水8%、檸檬汁1%配置好后，百合干花在此液中，按料液比1∶40 (g/mL)于80 ℃條件下浸泡20 min。

1.2.3 荊芥多糖制備 采用水提法。干燥荊芥粉碎并過40目篩。稱取10 g荊芥粉，加入300 mL水，加熱至60 ℃，保溫提取2 h。趁熱用6層滅菌紗布過濾、分裝入錐形瓶中，冷卻至室溫，4層食品級保鮮膜及1層食品級保鮮袋密封后，于4 ℃保存備用。按式(1)計算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——荊芥多糖的得率，mg/g；

C——荊芥汁中荊芥多糖的濃度，mg/mL；

V1——測定用荊芥汁體積，mL；

V——荊芥汁制備的總體積，mL；

M——荊芥干粉質量，g。

1.2.4 荊芥多糖標準曲線的繪制 參照文獻[9]修改如下：用1 mL移液管移取0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液各0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL。分別置于10 mL容量瓶中，均添加蒸餾水至1.0 mL，再加入1 mL 50 mg/mL苯酚溶液，然后再加入7 mL濃硫酸，定容，搖勻，放置至室溫，同時設置一組空白對照，490 nm處測定其吸光度，繪制標準曲線。

1.2.5 荊芥多糖制備的單因素試驗

(1)料液比對荊芥汁制備的影響：在浸提溫度60 ℃、浸提時間3 h的條件下，分別按料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)配置樣品，考察料液比對荊芥多糖提取的影響。

(2)提取時間對荊芥汁制備的影響：在浸提溫度60 ℃、最佳料液比的條件下，分別在浸提時間1，2，3，4，5 h 時測定多糖含量，以確定最佳的浸提時間。

(3)提取溫度對荊芥汁制備的影響：在最佳浸提時間，最佳浸提料液比的條件下，測定浸提溫度50，60，70，80，90 ℃下的荊芥多糖提取率以確定最佳提取溫度。

1.2.6 荊芥多糖制備的正交優化試驗設計 選擇提取時間、提取溫度、料液比為考察因素，各因素下設3個水平，按L9(34)設計正交試驗，以荊芥多糖的提取率作為參考標準，確定荊芥多糖最佳水提條件。

1.2.7 菌種活化及培養 在超凈工作臺上，用接種環分別挑取青霉菌、酵母菌菌種劃線至馬鈴薯固體培養基上，并置于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養44～48 h，取出放冰箱冷藏待用。再分別將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，置于37 ℃ 恒溫培養箱中培養22～24 h，取出放冰箱冷藏待用。

在超凈工作臺上，分別用接種環在5種菌的斜面培養基上各挑取5環菌，放置于相對應的5瓶250 mL的液體培養基中，混勻，在相應溫度下分別培養18～24 h和44～48 h，取出待用。

1.2.8 百合荊梨汁抑菌作用測定 采用濾紙片擴散法[8,16]。將配置好的百合荊梨汁分別以0%，20%，40%，60%，80%，100%加入6支試管中，再將配置好的液體培養基分別以100%，80%，60%，40%，20%，0%依次加入相對應的6支試管中，每支試管均有10 mL，依次做好標記。把濾紙片用打孔器打成直徑為5 mm的圓片，制作充足數量，然后滅菌，把滅好菌的濾紙片置于各種抑菌劑溶液中，且每種溶液中的濾紙片為10片，浸泡12 h。無菌水為對照。

將1.2.7制備好的菌懸浮液各取0.2 mL分別均勻涂布于相應培養基的平皿中，制成含菌平板，同時將在各種濃度抑菌劑浸泡好的濾紙片置于含菌平板中，做好標記，同時做3組平行試驗。青霉菌和酵母菌菌懸液分別放入28 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌菌懸液放入37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h。用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1.2.9 荊芥汁對百合荊梨汁抑菌作用影響 采用濾紙片擴散法測定抑菌效果。分別取已配置好的100%百合荊梨汁、荊芥汁和百合雪梨汁10 mL放入試管中，把滅好菌的濾紙片置于以上各種液體中，浸泡12 h。無菌水為對照。將1.2.7制備好的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液各取0.2 mL分別均勻涂布牛肉膏蛋白胨固體培養基平皿中，每個平板放置浸泡好的濾紙片，37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h。用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1.3 數據處理

在相同的條件下，每組試驗重復3次，試驗結果用平均值±誤差值表示，用SPSS 23進行數據處理，用SigmaPlot 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 繪制荊芥多糖的標準曲線

由圖1可知，吸光值隨葡萄糖含量的增加而增加，二者呈較好的正比例關系。通過統計分析獲得葡萄糖標準曲線的回歸方程為：Y=7.428 6X+0.098 6，R2=0.976 9。因此，所得標準曲線具有統計學意義，可用于試驗中多糖含量的測定。

圖1 葡萄糖標準曲線Figure 1 Standard curve of glucose

2.2 荊芥多糖制備工藝優化

2.2.1 單因素試驗 由圖2(a)可知，荊芥水提法中的料液比對荊芥多糖的提取有明顯的影響，隨著料液比的增加，荊芥多糖的提取率先上升后下降。當料液比為1∶10 (g/mL)時，提取率僅為(7.22±0.12)mg/g，當料液比為1∶30 (g/mL)時，荊芥多糖的提取率達到最高(27.55±0.41)mg/g，之后隨著料液比的增加，荊芥多糖的提取率開始下降，但下降速度較慢。分析原因，可能是料液比大時，由于液體較少，溶出物較多，達到飽和后不再溶出，隨著液體的增加，多糖溶出率不斷提高。但當料液比過高時，可能由于物料中其他物質的溶出增多，并可能與多糖結合，影響了其原本的特性，使其測定含量微有下降。雖然在不同料液比的提取中，溶出物間不斷地相互作用，但在料液比為1∶30 (g/mL)時，可以測得其最大提取率，因此，以1∶30 (g/mL)為最佳料液比。

由圖2(b)可知，在提取溫度60 ℃、料液比1∶30 (g/mL)的條件下，荊芥多糖的提取率先隨提取時間的延長呈先上升后下降的趨勢，荊芥水提至2 h時，荊芥多糖提取率最高，為(29.20±0.41)mg/g。1，3 h時，荊芥多糖提取率分別為(25.30±0.36)，(27.90±0.39)mg/g，4 h荊芥多糖提取率繼續下降，4，5 h 時下降得很快。以上現象可能是由于隨著提取時間的延長，多糖不斷溶出，2 h溶出達到最高后，再延長提取時間，多糖結構遭到破壞或降解，從而呈下降趨勢[16]。

圖2 料液比、浸提時間、浸提溫度對荊芥多糖提取率的影響Figure 2 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction temperature on the extraction yield of Schizonepeta polysaccharide

由圖2(c)可知，在最佳料液比1∶30 (g/mL)、提取時間2 h下，隨著提取溫度的不斷升高，荊芥多糖提取率呈現先上升后下降的趨勢。50 ℃時，荊芥多糖提取率為(25.80±0.29)mg/g。60 ℃時，荊芥多糖提取率為(29.35±0.37)mg/g。但提取溫度超過60 ℃時，荊芥多糖提取率逐漸下降。80 ℃時，多糖提取率迅速下降，可見荊芥多糖對提取溫度比較敏感，提取溫度較低時，可以增加植物細胞的通透性，促使多糖盡快溶出；提取溫度過高會破壞多糖中的某些化學鍵，改變其結構，致使得率下降。因此，60 ℃為荊芥多糖提取的最佳溫度。

2.2.2 正交試驗 根據單因素試驗結果，確定正交試驗因素水平取值見表1。

由表2可以看出，各因素對水提法提取荊芥多糖提取率的大小影響順序為料液比>提取時間>提取溫度，最佳提取條件為料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度60 ℃，提取時間2 h。在最優提取條件下，進行荊芥多糖的提取，重復3次，取平均值，最后測得荊芥多糖提取率為(29.43±0.16)mg/g，低于文獻[9]報道的荊芥多糖提取率(18.25%)。這可能與試驗原料及提取工藝有關。

2.3 荊芥汁對百合荊梨汁的抑菌能力

2.3.1 百合荊梨汁的抑菌能力 選擇細菌、霉菌和酵母菌3類菌中的常見5株菌作為試驗對象，測定了百合荊梨汁對其的抑菌效果。用十字交叉法測定抑菌圈直徑(包括紙片直徑)，3次平行試驗測量后取平均值，得出結果如表3所示。

表1 荊芥多糖制備的正交試驗因素水平Table 1 Levels and factors in orthogonal test of preparation of Schizonepeta polysaccharide

由表3可以看出，隨著百合荊梨汁體積分數的增加，對5種菌的抑菌效果均在不斷增強。尤其是當百合荊梨汁體積分數為80%時，抑菌效果比較明顯，當體積分數達到100%時，抑菌效果更好。表3中還顯示，同一體積分數百合荊梨汁溶液對不同菌種的抑菌效果也不同。當體積分數<80%時，同一體積分數的百合荊梨汁對5種菌的抑菌比較差，差別也較小。但當體積分數為80%時，百合荊梨汁仍然對青霉菌、酵母菌抑菌效果較差，但對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好。當用100%百合荊梨汁進行抑菌時，百合荊梨汁對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果增加得更多。可見，高體積分數的百合荊梨汁對細菌的抑菌效果較好，對霉菌和酵母菌的抑菌效果較差。

2.3.2 荊芥多糖對百合荊梨汁的抑菌能力的影響 對比圖3～圖5可以看出，在相應溫度下，培養相同時間后，測得的百合荊梨汁、荊芥多糖、百合梨汁細菌都有一定抑制作用，但百合梨汁大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果最差，百合荊梨汁的抑菌效果最強。因此可得，荊芥多糖的加入，增強了百合荊梨汁抑制細菌的能力。比較百合荊梨汁和荊芥多糖的抑菌活性發現，百合荊梨汁的抑菌效果還是較強。可見，荊芥多糖和百合梨汁混合后，有增強混合果汁抑菌功效的作用，從而使混合物呈現出高于兩種原料的抑菌活性，而不是呈現介于二者之間的抑菌活性。

表2 水提法提取荊芥多糖的正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of water extraction of Schizonepeta polysaccharide

圖3 百合荊梨汁、百合雪梨汁和荊芥汁對大腸桿菌菌抑菌效果Figure 3 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Escherichia coli

圖4 百合荊梨汁、百合雪梨汁和荊芥汁對枯草芽孢桿菌抑菌效果Figure 4 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Bacillus subtilis

圖5 百合荊梨汁、百合雪梨汁和荊芥汁對金黃色葡萄球菌抑菌效果Figure 5 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Staphylococcus aureus

3 結論

以荊芥多糖含量提取率為指標，通過單因素正交試驗對荊芥汁的制備工藝進行了優化，得出最佳制備工藝參數為：料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度60 ℃，提取時間2 h。在最優提取條件下，荊芥多糖提取率為(29.43±0.16)mg/g。與其他提取方法比較，此方法簡便經濟，且制備的提取液用于食品非常安全，可以直接應用到各種食品中。抑菌試驗表明，百合荊梨汁對青霉菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好抑制作用，但是對細菌的抑菌效果相對較好。進一步比較分析荊芥汁、百合梨汁和百合荊梨汁的抑菌能力，發現百合荊梨汁抑菌能力最強，荊芥汁的加入大大增強了百合荊梨汁抑菌能力。研究結果顯示，荊芥可以應用到飲品中以增強其抑菌活性。后續可以繼續對荊芥多糖進行進一步的分離純化，研究其抑菌機理、抗氧化活性等，為荊芥多糖的深入研究及進一步開發應用提供更多依據。