Tie2突變與兒童靜脈畸形相關(guān)性研究

徐文嬋 劉珍銀 陳欽諭 張靖

靜脈畸形（venous malformation，VM）舊稱海綿狀血管瘤，是人體最常見的良性、低流速脈管畸形，屬于靜脈發(fā)育畸形，約占血管畸形總數(shù)的95%[1]。VM 發(fā)病率為 1∶5 000～1∶10 000，男∶女比例約為1∶1，可發(fā)生于身體的任何部位，頭頸部與軀干部發(fā)病率均約為40%，四肢部約為20%[2]。

目前VM的治療方式主要包括介入硬化治療、手術(shù)治療、冷凍治療、激光治療以及放射性核素敷貼等，其中手術(shù)切除現(xiàn)已成為輔助治療手段，如應(yīng)用于硬化劑治療多次效果仍不明顯，而病灶體積巨大嚴(yán)重影響外觀與功能者等；放射性核素敷貼效果欠佳且遺留明顯的色素沉著，目前已很少應(yīng)用；激光治療深部病灶如腮腺內(nèi)、咬肌區(qū)的VM時，皮膚吸收較多激光而深部病灶并不能得到很好的治療，一旦增加功率又會給皮膚帶來較大損傷，因此不作為治療首選；血管內(nèi)硬化介入治療是目前國際主流的治療方式，主要優(yōu)勢為創(chuàng)傷小、療效明顯、可重復(fù)多次進行。但仍有部分患者對以上常規(guī)治療并不敏感，療效不理想，因此國內(nèi)外專家進行了更深入的發(fā)病機制研究，希望能在基因?qū)用鎸ふ业酵黄瓶凇?/p>

研究者早期即發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TEK，又稱Tie2），分布在血管內(nèi)皮細胞、造血干細胞和促血管生成單核細胞中[3-4]，但主要是在內(nèi)皮細胞中表達，其與配體ANG2發(fā)生特異性結(jié)合后對血管內(nèi)皮平滑肌細胞的通訊起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。隨著進一步的基因靶向研究表明，Tie2/ANG2信號通路在胚胎期、成人期的血管發(fā)育中均起著重要的調(diào)節(jié)作用，各種原因引起的基因突變可導(dǎo)致Tie2磷酸化水平升高，致使Tie2促血管生成的活性升高，從而導(dǎo)致畸形血管的發(fā)生；例如家族性皮膚黏膜靜脈畸形（venous malformation,cutaneuos and mucosal，VMCM）和約50%的散發(fā)性VM是由受體Tie2突變引起的[5-9]。基于此，本研究的目的是針對Tie2突變位點與VM發(fā)生的相關(guān)性進行初步探討。

資料與方法

一、研究對象

該項研究獲得廣州市婦女兒童醫(yī)療中心醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)和參與者的知情同意。本試驗VM病例組共納入VM患者56名，為2018年就診于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的患者，均符合國際診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡從1～10歲，平均年齡（4.5 ± 2.3）歲，男∶女比例為1∶1，病灶部位及數(shù)目詳見表1；健康對照組血液標(biāo)本來自于30名健康人群，男∶女為1∶1，年齡從1～10歲，平均年齡（4.3 ± 1.2）歲。VM病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）VM患兒疾病診斷依據(jù)符合“血管瘤和脈管畸形診斷和治療指南（2016版）”；（2）獲得知情同意；（3）資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）資料不完整，失訪；（2）既往接受其他治療。

二、DNA提取、準(zhǔn)備與純化

（一）主要試劑

（1） 基 因 組DNA提 取 試 劑；（2）PCR擴增試劑：引物（上海生工）；（3）瓊脂糖凝膠電泳試劑：DNA分子（Marker萊楓生物有限公司），TE緩沖液（上海生工）；（4）引物合成：PCR引物和測序引物合成由上海生工完成，針對Tie 2 基因13號外顯子的PCR正向引物F 5'-TCTGTCTGTGCCACTCTT-3'，反 向 引 物R 5'-CACGGTAATCCTATGTAA-3'，測 序 引 物5'-CACGGTAATCCTATGTAA-3'；（5） 測 序 試 劑：SAP酶（ABI公司），BDT（ABI公司），無水乙醇（上海生工）。

（二）主要步驟

1.提取外周血白細胞DNA

取外周血2 mL，用DNA提取試劑盒提取外周血白細胞DNA，所有離心操作均在室溫下進行。用洗脫緩沖液TE溶解，以紫外分光光度儀測定所有DNA樣品的純度和濃度，并保存于-80℃ 。

2.針對Tie2基因的13號外顯子進行引物設(shè)計

本試驗所設(shè)計的Tie2基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物見表1，PCR擴增條件流程見圖1。

表1 PCR反應(yīng)體系

圖1 PCR擴增條件流程

（三）純化

利用瓊脂糖凝膠電泳方法將PCR擴增的產(chǎn)物按照不同分子量分開，將含有目的產(chǎn)物的條帶用刀片切下來，用溶劑把凝膠溶解后再濃縮，然后回收溶液中的目的DNA片斷。

三、測序及結(jié)果處理與分析

采用直接測序法，即一代測序，由上海生工完成。測序結(jié)果用Chromas軟件分析核酸序列，在NCBI網(wǎng)站與已知序列進行比對。把所有個體的情況錄入預(yù)先設(shè)計Excel統(tǒng)計表中。將各組標(biāo)本的Tie2突變情況（如表2），采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

表2 56例病例樣本—VMs的臨床特征以及Tie2基因13號外顯子突變結(jié)果

結(jié) 果

本次研究中的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。其中VM病例組與健康對照組間在年齡（t檢驗，P＞ 0.05）與性別（男∶女均為1∶1）方面均無統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)具有可比性。本次試驗中納入的30例正常人血液標(biāo)本中檢測Tie2基因的13號外顯子突變率僅為3.3%（1/30），VM病例組突變率為57.1%（32/56）。

VM病例組內(nèi)進行卡方檢驗（校正公式，部分實際頻數(shù)＜ 5），χ2和P值如表3所列，P值均＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義；即不能認為VM的Tie2基因13號外顯子突變率與性別有關(guān)，不能認為患者出生時即有病灶還是出生后才有病灶有差別，不能認為病灶位于身體不同部位的突變率有差別VM病例組與健康對照組（總數(shù)n＜ 40）組間突變率的比較使用Fisher確切概率法（見表4）進行分析，發(fā)現(xiàn)兩組之間突變率不同，VM病例組突變率高于健康對照組（P＜ 0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 VMs組內(nèi)突變率的比較

表4 VM病例組與健康對照組間突變率的比較

討 論

VM患者最主要的癥狀就是疼痛，由于病灶具有侵蝕性，能跨組織生長，如同時累及皮膚軟組織與深部肌肉群甚至侵犯骨膜，因此無論是硬化治療還是手術(shù)切除，都只是限制病灶的繼續(xù)生長，而無法將病灶畸形血管完全清除。為此，針對這些介入硬化、手術(shù)治療、激光治療等現(xiàn)有的治療方式不敏感的難治性VM，科學(xué)家們在分子機制與靶向治療上進行了一系列更深入的研究。

VM是由血管發(fā)育畸形導(dǎo)致的疾病，以血管發(fā)育原理為重點的研究揭示了生長因子家族和細胞信號傳導(dǎo)機制（包括Ang/Tie2、Notch家族、TGFB/ALK1、FGF、S1P/EDG1、信號素 /神經(jīng)叢素、Netrin/UNC5B、細胞基質(zhì)/整合素信號傳導(dǎo)，以及其他調(diào)節(jié)血管生成性甲酚酶的途徑）對血管和淋巴管的形態(tài)發(fā)生、發(fā)育、成熟及穩(wěn)態(tài)都至關(guān)重要。研究證實Tie/ANGPT是內(nèi)皮細胞信號主要傳導(dǎo)途徑之一，Tie/ANGPT家族包括Tie1、Tie2 2種受體和 Angpt1、Angpt2 和 Angpt4 3 種 配 體[10-11]，Tie2分別與Angpt1和Angpt2結(jié)合從而介導(dǎo)血管成熟和血管生成[12-15]。如果在小鼠基因中敲除Tie2或Angpt-1會導(dǎo)致血管分支畸形改變，管壁平滑肌細胞嚴(yán)重覆蓋不足[15-16]。在發(fā)育的胚胎中，Angpt-1的缺失會導(dǎo)致血管網(wǎng)紊亂，畸形擴張的血管數(shù)量也會增加[17]。

Ang/Tie2信號通路在協(xié)調(diào)內(nèi)皮細胞行為、形成和重塑血管網(wǎng)絡(luò)的多個方面起著至關(guān)重要的作用。Tie2基因的突變可以引起血管畸形的發(fā)生，此類突變所致的VM共同點就是Tie2均有磷酸化（即活化），只是水平不等，但是目前的研究中包括本次研究均沒有發(fā)現(xiàn)突變率與任何臨床特征（性別、發(fā)病年齡、病灶數(shù)量、嚴(yán)重程度、類別或復(fù)發(fā)率）之間存在明顯的關(guān)聯(lián)。Ye等[18]鑒定出Tie2 17號外顯子的7個錯義突變，之前也有學(xué)者在散發(fā)性VM中報道過，但是57.1%（20/35）單突變率與L914F有關(guān)，與Limaye報道的100%（24/24）相差較遠，認為可能與人群種族不同、樣本大小不同等因素有關(guān)。Boscolo等[19]通過向免疫缺陷的小鼠注射最常見的引起VM突變類型L914F的HUVECs（人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞），從而建立小鼠VM模型，檢測雷帕霉素與Tie2抑制劑（Tie2-TKI）對小鼠VM的影響，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠有效降低突變體誘導(dǎo)的Tie2-Akt信號傳導(dǎo)，雖然確切機制不明但阻止VM進展的療效明顯；Tie2-TKI雖然是靶向抑制Akt信號傳導(dǎo)，但是作用弱，而且對Tie2具有劑量依賴性。在此基礎(chǔ)上Boscolo等又進行了一項前瞻性臨床試驗，對6名標(biāo)準(zhǔn)治療方式無效的VM患者采取雷帕霉素口服治療，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可明顯減輕疼痛、出血、病變大小、功能和美學(xué)損傷以及血管內(nèi)凝血障礙，第一次實現(xiàn)了VM的分子水平的試探性治療[19]。但是后期帶來的眾多二級臨床并發(fā)癥不得不納入考慮范圍，而且口服雷帕霉素對于病灶局限的VM患者療效與劑量也未知，雖然給我們提供了新的研究方向，但是目前并不建議臨床推廣使用。

本研究中靜脈畸形患者Tie2 13號外顯子突變率較正常人群顯著升高，這為對標(biāo)準(zhǔn)療法不敏感的難治性VM提供了新的思路。雖然關(guān)于此類脈管性畸形疾病的具體發(fā)病機制尚不明確，但是相信隨著分子生物學(xué)研究的進一步深入，在不久的將來分子治療領(lǐng)域一定能獲得突破性進展，不僅有利于疾病治療，更有利于此類疾病的產(chǎn)前診斷與預(yù)防。