羅非魚羅湖病毒的診斷及其防控建議

秦真東，林 蠡

(仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225)

近年來隨著羅非魚養殖密度和規模的不斷擴大，多種病害的頻繁暴發給全球羅非魚健康養殖產業造成嚴重威脅。值得注意的是，2009年以來，在以色列、厄瓜多爾和埃及等國相繼暴發養殖和野生羅非魚大量死亡事件，對全球羅非魚養殖構成了嚴重威脅。直到2014年，Marina Eyngo等通過分離鑒定才發現其病原是新型RNA病毒，并將該病毒命名為羅湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)。目前，該病毒相關研究還十分缺乏，特別是在我國廣泛養殖的羅非魚中的感染情況還未見詳細報道，也缺乏有關其綜合防控策略。本文從羅非魚感染羅湖病毒后的病理變化及其檢測方法建立，結合目前的研究現狀對羅非魚羅湖病毒提出綜合防控建議。

一、實驗魚感染

挑選健康的吉富羅非魚(廣東羅非魚良種場)，體質量(30±5)克，隨機分為兩組，每組10尾。感染組每尾魚腹腔注射200微升TiLV(病毒濃度1×106拷貝/毫升)，對照組注射等量滅菌的PBS。感染7天后，觀察魚體的臨床病理變化情況，并采集脾臟用于后續檢測。

二、臨床變化情況

羅非魚在羅湖病毒感染7天后發生顯著的臨床病理變化，如圖1所示。與對照組相比，感染羅湖病毒后，魚體活力明顯下降，嗜睡、眼部病變充血渾濁、皮膚糜爛和體色發黑，魚體黏液脫落明顯，鱗片脫落嚴重，尾鰭部分殘缺，身體表面出現明顯的出血現象。解剖后發現，整個鰓絲嚴重出血，內臟組織出血嚴重，特別是腸道膨脹出血，腸壁變薄，沒有明顯腹水存在，肛門紅腫不顯著。羅非魚感染羅湖病毒的大量死亡可能與呼吸功能衰竭以及內臟功能紊亂有一定關系，但是具體的原因還需要進一步深入研究。

三、羅湖病毒的檢測

將采集的脾臟組織提取總RNA，根據HIScript?Q Select RT SuperMix(諾唯贊，南京)說明書進行cDNA合成。采用套式RT-PCR方法對羅湖病毒進行檢測。

圖1 羅非魚感染羅湖病毒后的臨床變化

第一步反應：在0.2毫升PCR薄壁管中，按每個樣品20微升擴增體系配置，包括2×Taq Mix 10微升、10微摩/升上游引物(TiLV Nested ext-1)和下游引物(ME1)各1微升、雙蒸水6微升、cDNA模板2微升。擴增程序為95℃3分鐘；95℃30秒，55℃30秒，72℃0秒，共35個循環；72℃10分鐘，1%的瓊脂糖凝膠檢測。結果顯示，感染的兩條羅非魚均擴出1條450 bp的條帶(圖2)，而非感染羅非魚沒有檢測到條帶，通過在NCBI比對顯示與TiLV比對率為99%。

第二步反應：在0.2毫升PCR薄壁管中，按每個樣品20微升擴增體系配置，包括2×Taq Mix 10微升、10微摩/升上游引物(ME2)和下游引物(ME1)各1微升、雙蒸水6微升、cDNA模板(稀釋1 000倍)2微升。擴增程序為95℃3分鐘；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共35個循環；72℃10分鐘，1%的瓊脂糖凝膠檢測。結果顯示，在感染的兩條羅非魚均擴出1條250 bp的條帶(圖2)，而非感染羅非魚沒有檢測到條帶，通過在NCBI比對顯示與TiLV比對率為99%。

套式RT-PCR檢測結果表明，本實驗中的羅非魚確實感染了羅湖病毒，并且能夠特異性檢測出羅湖病毒。

圖2 TiLV套式PCR檢測結果

四、防控建議

目前沒有針對羅湖病毒的有效防治方法，因此只能通過建立綜合防控策略，減少羅湖病毒對羅非魚養殖產業造成的威脅。筆者對羅湖病毒的防控建議如下。

1.建立羅湖病毒流行病學調查

目前在埃及、厄瓜多爾、以色列等多地研究發現，羅非魚大量死亡主要發生在天氣炎熱的5-10月，因此猜測羅湖病毒主要暴發于溫度相對比較高的季節，而目前關于國內的流行情況仍然不清楚。因此，開展國內不同區域流行的情況對于防范羅湖病毒具有重要意義。流行病學調查的內容主要包括流行季節、水溫情況、水質環境情況、水域環境等，其次羅非魚的養殖密度、規模以及魚體尺寸等情況也是十分重要的調查對象。目前研究發現該病毒可以通過一個養殖池擴散到另一個養殖池，并且不同生長期的羅非魚也存在差異，因此開展羅湖病毒病流行病學調查對于防控羅湖病毒大規模暴發具有重要作用。

2.建立快速精準的檢測方法

目前人們在病原檢測方面已建立多種檢測方法，但是對羅湖病毒的檢測方法還十分缺乏。目前已經建立的方法有實時熒光反轉錄環介導等溫擴增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)、實時熒光定量RT-PCR、套式RT-PCR等，目前的檢測方法主要是建立在核酸水平，因此仍需開發更快速、精準的檢測方法。除了核酸檢測方法外，仍需建立蛋白質水平上的檢測方法，比如建立在特異性抗體上的ELISA檢測法、免疫熒光法以及免疫膠體金等方法。同時，建立對羅湖病毒敏感的細胞系也是檢測羅湖病毒重要的方法之一，可以更深入研究羅湖病毒的入侵機制。

3.加快技術攻關及有效藥物的篩選

羅湖病毒的大量暴發對羅非魚的健康養殖造成嚴重威脅，雖然目前在國內的暴發記錄不多，但是仍然需要做好技術攻關以應對其大量暴發。需要弄清楚羅湖病毒的感染途徑、復制方式以及致病機制。根據羅湖病毒的作用特征，開發應對的有效藥物，比如開發有效的中草藥，一方面可以增強魚體免疫力，另一方面可以直接抑制羅湖病毒的感染。同時，可以篩選合適的飼料添加劑，比如多糖類藥物等，提高魚的免疫力，減少魚的死亡率。

4.保持良好養殖水域環境

良好的養殖水域環境是緩解病害發生重要因素，如何保持良好的水質，顯得十分重要。足夠的溶氧，合適的養殖水溫，定期檢測氨氮、亞硝酸鹽等水質指標，定期對水質進行改良，一方面可以提高養殖魚的免疫力，另一方面也可以減少對魚體的應激。同時，控制合適的養殖密度，投喂優質飼料以及合適的投食量也是保持水質良好重要的因素。總之，實時保持水質良好對于防控羅湖病毒的暴發也至關重要。

5.開發高效特異的疫苗

高效特異的疫苗仍然是防控病毒暴發的最有效途徑。疫苗種類繁多，包括弱毒疫苗、亞單位疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗等，各有特點，均可以在防控羅湖病毒中發揮重要作用。此外，開發高效特異性的卵黃抗體也是防控羅湖病毒的良好選擇。總之，開發高效特異的疫苗是防控羅湖病毒眾多防控手段中最直接、最有效的選擇。

6.其他

防控羅湖病毒除了上述手段外，還需要做到精細化管理，開發更加優質的羅非魚苗種，做好病毒溯源、親魚和苗種的監測等，通過多種防控方法，共同防控羅湖病毒。

五、總結

經過學者多年的不懈研究，目前已經初步建立了羅湖病毒的分離鑒定以及檢測方法，相信隨著研究的不斷深入，將會出現更多快速精準的檢測方法和防控手段，共同為羅非魚養殖產業的健康發展保駕護航。