醋酸桿菌A.pasteurianus SP001冷凍干燥工藝研究

孫一帆，陳思，梁新紅，高瑩瑩

(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

隨著人們生活水平的不斷提高和對(duì)食醋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保鍵功能的充分認(rèn)識(shí)，以及科學(xué)研究對(duì)果醋功效特性的提示，市場(chǎng)上對(duì)果醋的需求量越來(lái)越大[1-3]。醋酸桿菌是醋酸發(fā)酵工業(yè)的主要用菌[4-5]，因醋酸菌具有自滅性、易變異，不易保藏等特點(diǎn)[6]，所以對(duì)醋酸桿菌的保藏方法和效果的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了在釀造生產(chǎn)過(guò)程中選育到優(yōu)秀的醋酸菌菌株，選擇適宜的保藏方法尤為重要。醋酸桿菌的常規(guī)保藏方法為斜面保藏和液體保藏，都需要定期傳代[7]。但是醋酸桿菌與其他菌種不同，很容易變異[8]。而定期傳代又增加了其退化和變異的概率，這樣會(huì)使寶貴的醋酸菌菌株得而復(fù)失，讓今后的研究不能正常進(jìn)行，甚至可能會(huì)給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)很大的損失和危害[9]。因此，為了保持醋酸菌的優(yōu)良性狀和活力，選擇適宜的保藏方法尤為重要[10]。在眾多醋酸桿菌的保藏方法中，真空冷凍干燥保藏的方法提供的低溫、真空以及干燥的條件，可以使所保藏的菌株活性保存10年以上，且當(dāng)菌種被應(yīng)用時(shí)，只需要添加水分進(jìn)行復(fù)水活化，具有使用方便、易保藏等特點(diǎn)[11-12]。

真空冷凍干燥方法的基本工藝是先將目標(biāo)菌株進(jìn)行高密度培養(yǎng)，在菌株活力和濃度較高時(shí)收集菌體，然后將收集到的菌體懸浮在適宜的冷凍保護(hù)劑中進(jìn)行預(yù)凍，真空冷凍干燥過(guò)程中影響微生物活性的因素很多，其中預(yù)凍溫度和保護(hù)劑種類的影響尤為突出[13-15]。本試驗(yàn)主要研究了保護(hù)劑的種類和預(yù)凍溫度對(duì)醋酸桿菌活菌數(shù)及產(chǎn)酸量的影響，以期為果醋工業(yè)生產(chǎn)提供高活性醋酸菌凍干粉。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

醋酸桿菌：A.pasteurianusSP001, 河南科技學(xué)院食品學(xué)院分離、鑒定、純化。

1.1.2 試劑

酵母膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、葡萄糖、無(wú)水乙醇、瓊脂、K2HPO4、氫氧化鈉、海藻糖、磷酸鉀緩沖液(分別配制濃度為0.05 mol/L的KH2PO4和0.05 mol/L的K2HPO4溶液，然后將配制好的兩種溶液混合，調(diào)節(jié)pH值范圍為5.5～6.0即可)、甘露醇、結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、沙黃、香柏油、二甲苯。

1.1.3 主要儀器

SW-CJ-ID單人單面垂直送風(fēng)(經(jīng)濟(jì)型)凈化工作臺(tái) 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；WFJ7200分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司；FA124電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHP恒溫生化培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；XSP-BM-2CA生物顯微鏡 上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；H1850R離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；1-4LSC冷凍干燥機(jī)、搖床 上海通特電訊設(shè)備廠；PHS-3C pH計(jì) 上海盛磁儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冷凍干燥前菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1.2.1.1 液體培養(yǎng)基的配制

酵母膏1%、MgSO4·7H2O 0.2%、KH2PO40.3%、葡萄糖2%、pH值自然，于121 ℃滅菌20 min，備用，使用時(shí)加入3%的無(wú)水乙醇。

1.2.1.2 培養(yǎng)

分別編號(hào)1，2，3，4，5，6，7。每個(gè)錐形瓶中含液量100 mL，按照無(wú)菌操作法向7個(gè)錐形瓶中分別加入3%的無(wú)水乙醇和10%的果醋。接種后的錐形瓶置于搖床上，在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，其中1號(hào)置于冰箱中作為對(duì)照。

1.2.1.3 測(cè)定

每隔3 h于波長(zhǎng)610 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定上述細(xì)菌菌懸液的吸光值。

1.2.1.4 繪制曲線

以細(xì)菌菌懸液的吸光值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 菌懸液的制備

取3瓶裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中含液量100 mL，按照無(wú)菌操作法向3個(gè)錐形瓶中分別加入3%的無(wú)水乙醇和10%的葡萄醋。接種后的錐形瓶置于搖床上，在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌密度最大，于4 ℃保存，用于冷凍干燥。

1.2.3 冷凍干燥

將菌密度達(dá)到最大時(shí)的菌懸液在9600 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，倒去上清液，沉淀物用磷酸鉀緩沖液溶解后在上述條件下再次離心，除去上清液后沉淀物用保護(hù)劑溶解，然后倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中的液體厚度不能超過(guò)2 mm。將上述分裝好的培養(yǎng)皿口用保鮮膜封好，置于不同的溫度條件下預(yù)凍12 h，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.3 分析方法

1.3.1 活菌計(jì)數(shù)

液體培養(yǎng)基的配制：酵母膏1%、MgSO4·7H2O 0.2%、KH2PO40.3%、葡萄糖2%、瓊脂2%、pH值自然，于121 ℃滅菌20 min，備用，使用時(shí)加入3%的無(wú)水乙醇。在無(wú)菌工作臺(tái)上，將凍干后的菌種用無(wú)菌水溶解，用移液槍吸取0.3 mL的稀釋液于平板上，然后置于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.2 醋酸含量的測(cè)定

以標(biāo)定后的氫氧化鈉溶液(濃度接近0.1 mol/L)滴定發(fā)酵液，指示劑為酚酞試劑，結(jié)果以醋酸(g/dL)計(jì)。為了保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次測(cè)定進(jìn)行統(tǒng)一操作，步驟：1 mL發(fā)酵液→加入9 mL蒸餾水→加2滴酚酞→滴定記錄。

1.3.3 產(chǎn)酸曲線的測(cè)定

將干燥后的菌種用無(wú)菌水溶解，接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，測(cè)定其產(chǎn)酸量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、產(chǎn)酸量(g/dL)為縱坐標(biāo)繪制曲線，并與冷凍干燥前菌株的產(chǎn)酸量進(jìn)行對(duì)比。

1.3.4 凍干前后酒精轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

將凍干前后的菌株接入液體培養(yǎng)基中，測(cè)定其最大產(chǎn)酸量，進(jìn)而計(jì)算其酒精轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率(%)=產(chǎn)酸量(g/L)/發(fā)酵液酒精含量(g/L)/1.304。

產(chǎn)酸量(g/L)=最大產(chǎn)酸量(g/L)-培養(yǎng)基含酸量(g/L)-接入菌種的含酸量(g/L)。

1.3.5 冷凍干燥前后菌株在葡萄酒中的發(fā)酵效果的比較

分別將冷凍干燥前后的菌株接入液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、100 r/min 的搖床中培養(yǎng)3～4 d，使菌株活化，然后按照10%的接種量分別將冷凍干燥前后的菌種接入葡萄酒中，測(cè)定其產(chǎn)酸量，從而對(duì)真空冷凍干燥前后的菌株在葡萄酒中的發(fā)酵效果及發(fā)酵周期進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用DPS 7.55數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍干燥前醋酸桿菌SP001生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

按照1.2.1所述生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法，分別將編號(hào)1，2，3，4，5，6，7的每個(gè)錐形瓶中裝入液體培養(yǎng)基100 mL，按照無(wú)菌操作法向7個(gè)錐形瓶中分別加入3%的無(wú)水乙醇和10%的米醋。接種后的錐形瓶置于搖床上，在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，其中1號(hào)置于冰箱中作為對(duì)照。然后每隔3 h于波長(zhǎng)610 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌菌懸液的吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 冷凍干燥前A. pasteurianus SP001的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of A. pasteurianus SP001 before freeze drying

由圖1可知，0～10 h為A.pasteurianusSP001的延滯期，12～36 h為A.pasteurianusSP001的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36～66 h為穩(wěn)定期，66 h后，菌體生長(zhǎng)速率小于其死亡速率，進(jìn)入衰亡期。因此，用于真空冷凍干燥的菌體應(yīng)為培養(yǎng)到36 h的菌體，以使冷凍干燥后獲得較多的菌體。

2.2 預(yù)凍溫度對(duì)冷凍干燥后菌種活性的影響

依據(jù)1.2.3和1.3.1的方法，對(duì)預(yù)凍后的菌體進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 預(yù)凍溫度對(duì)冷凍干燥后菌株活性的影響Fig.2 Effect of pre-freezing temperature on the activity of bacteria after freeze drying

由圖2可知，預(yù)凍溫度為-30 ℃時(shí)，當(dāng)保護(hù)劑為10%的葡萄糖+2%的海藻糖時(shí)，其活菌數(shù)為(450±21) CFU/mL，當(dāng)保護(hù)劑為10%的甘露醇時(shí)，其活菌數(shù)為(260±12) CFU/mL。而當(dāng)預(yù)凍溫度為-60 ℃時(shí)，兩種保護(hù)劑的活菌數(shù)分別為(680±23) CFU/mL和(500±19) CFU/mL。當(dāng)預(yù)凍溫度為-90 ℃時(shí)，兩種保護(hù)劑的活菌數(shù)分別為(520±16) CFU/mL和(310±12) CFU/mL。-60 ℃預(yù)凍的效果比-30 ℃預(yù)凍的效果較好，這可能是因?yàn)榫鷳乙涸?30 ℃預(yù)凍時(shí)，其溫度已降至冰點(diǎn)以下，但結(jié)冰不夠堅(jiān)實(shí)，真空干燥時(shí)易使菌懸液沸騰，菌體細(xì)胞受損失較多。而在-60 ℃預(yù)凍時(shí)，結(jié)冰速度快且堅(jiān)實(shí)，細(xì)胞損傷較少。因此，-60 ℃的預(yù)凍溫度最好。

2.3 保護(hù)劑種類對(duì)冷凍干燥后菌株活性的影響

2.3.1 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后狀態(tài)的影響

按照1.2.3所述的方法進(jìn)行真空冷凍干燥，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，菌體與保護(hù)劑的混合物失去水分而成干燥狀態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 10%的葡萄糖+2%的海藻糖

圖4 10%的甘露醇

由圖3和圖4可知，保護(hù)劑為10%的葡萄糖+2%的海藻糖時(shí)，冷凍干燥后培養(yǎng)皿中的糖分殘余物較少，而當(dāng)保護(hù)劑為10%的甘露醇時(shí)，培養(yǎng)皿中的固體殘余物較多，冷凍干燥后除去水分，使甘露醇過(guò)飽和而析出，與溶解前的狀態(tài)無(wú)太大差異，因此從這方面來(lái)看，以10%的葡萄糖+2%的海藻糖為保護(hù)劑的冷凍干燥效果比較好。

2.3.2 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后菌種活性的影響

按照1.2.3和1.3.1的方法，對(duì)不同保護(hù)劑對(duì)冷卻干燥后菌株活性進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥后菌株活性的影響Fig.5 Effects of different protective agents on the activity of bacteria after freeze drying

由圖5可知，在-60 ℃的預(yù)凍溫度下，以10%的葡萄糖+2%的海藻糖為保護(hù)劑時(shí)，活菌數(shù)為(680±23) CFU/mL，而當(dāng)以10%的甘露醇為保護(hù)劑時(shí)，活菌數(shù)為(500±19) CFU/mL。兩者相差180 CFU/mL，因此，由上述結(jié)果可知以10%葡萄糖+2%的海藻糖為保護(hù)劑的細(xì)胞存活數(shù)較高，而以10%的甘露醇為保護(hù)劑的細(xì)胞存活數(shù)較低。因此，選擇10%的葡萄糖+2%的海藻糖作為A.pasteurianusSP001的凍干保護(hù)劑。

2.4 冷凍干燥干燥前后菌種產(chǎn)酸曲線的比較

按照1.2.1和1.3.2的方法，將干燥前后的菌種分別接種在液體培養(yǎng)基中，測(cè)定其產(chǎn)酸量(g/dL)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 冷凍干燥前后菌種的產(chǎn)酸量比較Fig.6 Comparison of acid production of bacteria before and after freeze drying

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，冷凍干燥前后的菌種在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸量都有所增加，真空冷凍干燥前的A.pasteurianusSP001在第7天時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到了最大值，即(2.86±0.08) g/dL，而冷凍干燥后的菌種在第9天的達(dá)到最大產(chǎn)酸量(2.63±0.07) g/dL，兩者的最大值相差0.23 g/dL，相差量為8.1%，但是，在醋酸發(fā)酵的第3天到第5天，冷凍干燥前后產(chǎn)酸量明顯不同，冷凍干燥后菌種延滯期延長(zhǎng)，因此，要獲得較高產(chǎn)酸量，冷凍干燥后A.pasteurianusSP001發(fā)酵時(shí)間最佳為9 d。

2.5 凍干前后乙醇轉(zhuǎn)化率的比較

依照1.3.3的方法，將凍干前后的菌種接入培養(yǎng)基中，測(cè)定其最大產(chǎn)酸量，計(jì)算其酒精轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 冷凍干燥前后菌種的酒精轉(zhuǎn)化率Table 1 The ethanol conversion rate before and after freeze drying

由表1可知，真空冷凍干燥前菌種的酒精轉(zhuǎn)化率為73.00%，冷凍干燥后菌種的酒精轉(zhuǎn)化率為67.67%，表明冷凍干燥對(duì)菌株與未凍干菌株的活性有差異顯著性，其差值為5.33%。

2.6 冷凍干燥前后菌種在葡萄酒中發(fā)酵效果

按照1.3.5的方法，分別將冷凍干燥前后的菌種接入葡萄酒中，將葡萄酒發(fā)酵轉(zhuǎn)化為葡萄醋，在發(fā)酵過(guò)程中，測(cè)定其產(chǎn)酸量(g/dL)，分析冷凍干燥前后菌種的活性以及發(fā)酵周期的差別，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 冷凍干燥對(duì)A. pasteurianus SP001在葡萄酒中發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of freeze drying on the fermentation of A. pasteurianus SP001 in wine

由圖7可知，真空冷凍干燥前，菌種在葡萄酒中發(fā)酵，在第10天就達(dá)到最大產(chǎn)酸量(6.06±0.14) g/dL，而冷凍干燥后的菌種在第13天時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)酸量(5.85±0.15) g/dL，并趨于穩(wěn)定。冷凍干燥前后最大產(chǎn)酸量相差0.21 g/dL，其相差量為3.5%，但是冷凍干燥后的發(fā)酵周期卻延長(zhǎng)1 d。

3 結(jié)論

以A.pasteurianusSP001為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)真空冷凍干燥過(guò)程中預(yù)凍溫度和保護(hù)劑種類的研究，采用10%葡萄糖+2%海藻糖制成的醋酸菌保護(hù)劑，經(jīng)-60 ℃的預(yù)凍所制成的凍干菌的保藏效果良好。A.pasteurianusSP001培養(yǎng)36 h后進(jìn)行冷凍干燥，凍干粉在乙醇含量為3%(V/V)培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 d時(shí)醋酸產(chǎn)量最大，產(chǎn)值為(2.63±0.07) g/dL，在乙醇含量為6%(V/V)葡萄酒中發(fā)酵第13天醋酸產(chǎn)量最大，產(chǎn)值為(5.85±0.15) g/dL。真空冷凍干燥后菌種活性較好，能夠進(jìn)行果醋釀造的工業(yè)應(yīng)用。A.pasteurianusSP001凍干粉發(fā)酵時(shí)間相對(duì)新鮮菌種較長(zhǎng)，其原因及機(jī)理還需進(jìn)一步研究。隨著果醋釀造技術(shù)的發(fā)展以及真空冷凍干燥微生物技術(shù)的日益完善，真空冷凍干燥醋酸菌粉必將為果醋行業(yè)提供巨大的發(fā)展空間，也將為我國(guó)食品行業(yè)的發(fā)展做出很大的貢獻(xiàn)，相信在未來(lái)會(huì)有更完善的技術(shù)和設(shè)備在這方面加以應(yīng)用。