泡菜發酵中微生物的研究

趙虎威，陳燕飛，燕平梅

(太原師范學院 生物系，太原 030619)

1 概述

泡菜常常作為其他食物的輔料來食用，以使其他食物更有食欲或更容易消化?，F在泡菜已經成為全世界各國人們飲食的重要組成部分。泡菜發酵過程中原料或底物的多樣性或工藝參數的不同，使發酵產品種類繁多，這種多樣性也反映在微生物的多樣性上，這些微生物是影響和推動泡菜發酵和工業化過程的主要因素和生物化學控制因素。泡菜微生物在泡菜發酵中被培養和發現，這些微生物對經過發酵的泡菜最終產品的影響及其味道、質地和氣味都至關重要。研究泡菜的成果引起了人們的重視和興趣，經常食用新鮮的泡菜可以有效促進人們大腸和胃的正常蠕動，從而有效防止了肥胖和便秘。泡菜可以有效幫助抵抗和抑制細菌，還可幫助人體預防惡性腫瘤的發生和癌細胞的形成，以及幫助調節和維持人體的正常生理和內分泌機能等。泡菜的發酵，由一些在蔬菜及其制品表面產生或附著的微生物來進行發酵和完成，參與各種用于泡菜及其制品發酵的微生物種類比較多，數量也較大，其中主要包括常見的乳酸菌、酵母菌、霉菌、腸桿菌、其他同科的各類中性細菌、假單胞雙胞芽桿菌及其他同屬的各類細菌等。對泡菜發酵過程起主要輔助作用的微生物是乳酸菌，而除乳酸菌之外的其他酵母菌、醋酸菌和霉菌等各種微生物則對泡菜發酵起到了各種輔助發酵的重要作用[1]。此外，某些泡菜在其整個發酵期間與其酵母中的菌類還通過酯化發酵加成反應合并生成乳酸乙醇以及其他芳香醇類[2]。目前，對來自世界各國的各種泡菜及其相關制品中各種乳酸菌及其他微生物菌種的化學發酵機理作用問題研究很多，據各國媒體報道，韓國的各類泡菜中仍存在各種發酵乳酸菌及其微生物高達30多種。而且近年來，世界各國和我國本土對于泡菜制品發酵中乳酸菌類微生物的發酵作用研究也愈發深入。

2 文獻綜述

2.1 泡菜的腌制

泡菜的制作源于我國， 制作的原料主要是各種新鮮的蔬菜，把它們一起放入低鹽溶液中，經過與乳酸菌等多種常見微生物混合進行發酵從而加工產生的一種美味可口的食品。在我國、日本、德國和朝鮮等國的歷史悠久，從古至今發酵泡菜都受到了許多家庭和消費者的青睞和喜愛。泡菜略帶咸味和酸性，味道鮮嫩，可以增進食欲，幫助消化，并具有一定的醫療和保健益處。

容器、鹵水和調味料是制作泡菜的3個關鍵因素。制備泡菜的容器應具有良好的耐熱性、搪瓷性、吸水性，無裂紋、無沙眼和清脆的鋼聲音的泡菜壇。正確的原料選擇是使用新鮮和季節性的泡菜品種來提高泡菜的營養價值，且需質地鮮嫩，肉厚、肉質硬健，無任何蚊蟲叮咬、爛痕、斑點者為佳；泡菜鹽水的正確配制對新鮮泡菜產品的質量也具有重要性的影響，一般可以選擇使用含鹽和礦物質較多的水來配制泡菜鹽水， 制作鹵水的食鹽應選用品嘗起來含有苦味較少、礦物質含量也極少等品質良好的。泡菜鹵水中食鹽成分含量對其內的微生物數量和種類影響很大，而微生物的數量又與泡菜中的pH、酸度密切相關，所以食鹽要適宜[3]。不同發酵原料和鹽水中含鹽量和pH值均會影響泡菜中酵母菌數量的多少[4]。料酒、蔗糖、高粱酒、蔥、姜、蒜、辣椒、八角、草果、花椒、胡椒等調味料則是泡菜風味形成的關鍵，白酒和料酒使鹽味更好地滲透進泡菜中，還可以殺死發酵過程中的某些有害菌；蔗糖和辣椒可以調和味道、增加鮮味以及防止泡菜變質；八角、花椒等可以起到增香、除去泡菜鹵水中腥味的功效。周佳等研究表明泡菜的最適宜發酵條件為：鹵水中食鹽濃度為0.04，發酵溫度為30 ℃，蔗糖濃度為0.03，乳酸菌、植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的最佳配比為3∶1∶1，該條件下得到的泡菜口感較佳[5]。

制作泡菜要先將蔬菜原料清洗干凈放在一旁瀝干水分，瀝干后將其切成適宜大小，在其表面撒上一層薄薄的鹽，然后將其放入泡菜壇中先腌制7～8 h，讓鹽分充分融入蔬菜中。接著將白酒、紅糖、辣椒、八角、花椒、胡椒等調味料放入泡菜壇中，充分攪拌，使其和泡菜充分混合，再用泡菜壇蓋蓋上壇口，將涼水倒置其上,摻滿壇沿即可，然后將其放在溫度適宜的環境中發酵。熊濤等研究不同發酵溫度對鹵水的pH值、微生物數量和種類、有機糖、乳酸、乙酸和乙醇等含量的影響[6]。結果表明：鹵水的溫度會影響泡菜發酵中乳酸菌的生長繁殖。泡菜發酵環境的溫度越高，越適宜乳酸菌的繁殖和代謝；當泡菜環境溫度低時，適合酵母菌和大腸桿菌的存活和繁殖。所以，泡菜發酵的溫度以15～25 ℃為宜。

2.2 泡菜微生物研究概況

2.2.1 國外泡菜微生物研究概況

泡菜一直以來都受到人們的關注，尤其是在“注重健康”的發達國家，其健康效益也在不斷增加。蔬菜是營養物質的豐富來源，如維生素A、B、C、D等各類礦物質，益生菌纖維和生物活性植物化合物，包括酚酸、黃酮類、植物雌激素和生物活性肽。越來越多的科學研究表明，食用富含蔬菜的飲食與降低和年齡相關的風險之間存在著積極的關系。因此，越來越多的國外學者對研究泡菜發酵中的微生物與身體健康等方面越發感興趣。Sebastian等[7]主要敘述了蔬菜和水果有一個微生物種群，該微生物區系中，主要由有益的微生物組成，包括酵母菌、畢希亞、念珠菌、托拉斯波真菌屬(根霉)、有氧(芽孢桿菌和醋桿菌)和厭氧(乳酸菌)細菌，通常負責生蔬菜和水果的自然發酵，有助于它們的保存和穩定性。Carl等則綜述了泡菜中的維生素含量，并對泡菜的細菌學變化進行了研究[8]，表明泡菜的發酵是由Leuconostoc、短乳桿菌和植物乳桿菌3種微生物生長和發酵的結果。

2.2.2 國內泡菜微生物研究概況

我國泡菜的微生物研究起源于20世紀30年代，典型成果有“乳酸菌主導發酵”，20世紀40年代則是采用傳統方法鑒定并首次提出“乳桿菌屬主導發酵”，這是我國老一輩科學家在泡菜微生物研究領域的重要發現。20世紀80年代和90年代，我國泡菜微生物研究進入了快速發展時期，結合國內外研究現狀，我國的學者們首次提出了中國泡菜的三階段式發酵，這也說明了泡菜發酵的動態變化。這一時期，大量的專家和學者采用可培養乳酸菌等微生物的手段深入研究了我國泡菜中的微生物，大大地豐富了我們對中國泡菜中微生物品種和菌群的了解和認識。

進入21世紀，隨著我國分子泡菜微生物學研究技術的快速進步和發展，采用了一種將傳統泡菜分離乳酸菌的純化與現代分子泡菜微生物學鑒定(如16S rDNA)的方法使有機結合的技術手段被廣泛應用于對泡菜乳酸菌微生物的科學研究中，2005年以后逐漸出現了PCR-DGGE、克隆文庫等免培養方法研究泡菜微生物，過去一些難以培養的如嗜鹽微生物、非乳酸菌細菌等大量被發現，進一步推動了泡菜微生物學的發展。而近年來宏基因組測序、定量PCR等手段的興起也帶動了泡菜微生物學研究的深入開展。尤其是四川在泡菜研究方面，在傳統微生物學方法的基礎上，應用現代分子微生物技術系統開展了四川省內各個不同地區的泡菜微生物菌群結構及變化的研究，第一個確定了明串珠菌、乳桿菌和乳球菌這3個屬17個種的乳酸菌是主要優勢菌群，之后應用多重PCR、高通量測序等方法進一步確定了泡菜中的主要優勢菌群，建成我國國內首個泡菜微生物菌種的資源庫。

2.3 泡菜所含微生物的種類

2.3.1 乳酸菌對泡菜發酵的作用

乳酸菌幾乎無法直接分解植物纖維素并且不能水解植物蛋白質，因此乳酸菌幾乎不會在泡菜植物發酵的過程中直接破壞植物細胞的纖維組織。乳酸菌可以產生多種氨基酸、維生素和酶，從而提高和改善泡菜的營養價值。乳酸菌通過厭氧發酵產生乳酸、丙酸等，可以使泡菜中形成一些酸性細菌，使泡菜產品具有柔軟的酸味，并且可以抑制泡菜發酵環境中某些腐敗微生物和致病微生物的生長。同時，泡菜在發酵過程中自然產生的庚酮和壬酮的類乳酸菌素還可以幫助使蔬菜產品的口感更加清新。乳酸菌屬的微生物還可以分解產生許多具有一定抗菌活性的化學物質，如乙醇、二乙?；?、過氧化氫等，可以有效防止泡菜變質，延長其保質期[9]。植物乳酸菌發酵可以豐富各種泡菜產品以滿足市場需求并創造更多的經濟效益。

乳酸菌是參與調節人體腸道微生態平衡的主要菌系，具有益生菌的潛力[10]，它們也使得泡菜具有醫療保健的作用。Cortés-Rodríguez Viridiana等研究發現，泡菜發酵主要是乳酸菌的作用，并已經顯示益生菌的特點包括：膽固醇還原和膽固醇同化；抗氧化活性離體；抗腫瘤活性；免疫調節；抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性致病菌的生長發育[11]。這些從泡菜發酵中分離出來的乳酸菌的特性支持了食用這些乳酸菌可能有益于人類健康的觀點。

2.3.2 酵母菌對泡菜發酵的作用

酵母菌能產生少量氣體，能產生有機醇，不產有機酸，利用還原糖的能力強，能產生脂類物質，更能適應高酸和高鹽環境；酵母菌與其他植物乳桿菌共同進行發酵時會產生更多的酸[12-13]。酵母菌與乳酸菌共同混合發酵不僅要遠遠優于其他菌與乳酸菌共同發酵時的各項理化性能指標和感官味覺性能，而且發酵形成的泡菜成品還具有更好的泡菜風味和特殊口感[14]。酵母菌還具有一定的對DPPH酶等自由基酶的清除培養能力以及抗體細胞自動化的聚集培養能力。酵母菌可以促進植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和腸膜明串珠菌這3種乳酸菌的生長繁殖[15]。

2.3.3 醋酸菌對泡菜發酵的作用

因為泡菜發酵過程中用到了醋這類調味品，所以泡菜中會存在一定量的醋酸菌。醋酸菌是一種原核生物，在自然界中分布廣泛，屬于異養需氧型微生物，在泡菜發酵過程中需要氧氣。醋酸桿菌在泡菜的整個發酵過程中能將其中形成的少量乙醇氧化成醋酸，然后將生成的醋酸和少量乳酸氧化成少量二氧化碳和水，并且醋酸菌還具有較高的抗乙酸能力[16]。醋酸菌在泡菜發酵過程中主要起到在泡菜發酵中輔助乳酸菌共同完成發酵泡菜的作用。因為有些菌株能夠合成纖維素組成細胞壁外的基質，而細菌則埋置于纖維素微絲纏結的片層中。

2.3.4 霉菌對泡菜發酵的作用

霉菌屬于真菌，生長和繁殖速度較快，菌落呈絨毛或蜘蛛網狀。發酵產品中常用的霉菌主要是曲霉菌、毛霉菌和青霉菌。霉菌在泡菜發酵過程中主要將蔬菜等原料轉化為其他物質，如有機糖、淀粉、纖維素、蛋白質等。在泡菜發酵的起始時間，霉菌起著重要的作用。但是，霉菌還會污染泡菜產品，并使其變質，甚至致畸、致癌和致突變。在泡菜發酵的后期，霉菌會分解原料中的蛋白質，嚴重影響泡菜的味道，還為其他有害微生物的生長繁殖提供了適宜的條件[17]。

2.4 微生物的研究方法

2.4.1 傳統的鑒定方法

通過對泡菜中的微生物進行分離、純化、培養一系列操作，對其在特定培養基上所表現出來的特性進行研究以鑒定微生物種類，這些特征包括形狀、大小、正反面顏色、邊緣形狀、隆起、黏稠度、透明度、氣味等。

除上述物理特征外，還可采用生理生化反應來對其進行研究，如對碳源、氮源等能源的需求，對生長因子的要求，其代謝產物的類型，進行染色反應所表現出來的特征以及研究微生物生長的溫度范圍，最適、最低和最高生長溫度。

2.4.2 16S rRNA寡核苷酸的序列分析

細菌中包括3種核糖體RNA，分別為5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。5S rRNA雖然易分析，但其中含有的基因核苷酸只有幾十個bp長度，沒有提供足夠的具體遺傳化學信息；23S rRNA含有的基因核苷酸的個數則太多，進行遺傳分析時較困難。而16S rRNA序列基因中的核苷酸各個序列之間長度變化適宜，序列長度變化與基因進化距離相符合適應，對各類微生物細胞進行基因序列變化分析的研究結果更準確。所以，現在一般建議采用16S rRNA對微生物進行基因測序優化分析。

16S rRNA序列分析的具體步驟為：對原始序列數據進行預處理，包括條碼序列解復用、質量濾波、去噪、嵌合體檢測和數據歸一化；然后進行微生物多樣性分析：先進的數據分析和可視化。

2.4.3 變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)

變性梯度凝膠電泳被廣泛地應用于微生物科學分子群體生態學學術研究的各個領域，目前已經逐步發展并成為專門研究各類微生物分子群落形態結構的主要分子形態生物學研究方法之一。DGGE系統是一種基于DNA材料片段的變性熔融分解梯度特性將其加熱分離的凝膠電泳系統。DGGE是根據DNA片段在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開，現已廣泛應用于多樣性基因調查、親緣之間關系活性鑒定、基因突變活性檢測等領域。

2.4.4 高通量測序(high-throughput sequencing)

利用高通量序列測序分析技術可以一次對幾十萬到幾百萬條諸如DNA的分子序列進行細致序列分析測定。高通量測序技術的主要工作原理為：將測序目標中的DNA分子剪切為小塊的片段；然后將DNA兩個分子相互結合后放到一個固相分子表面；并對單片段DNA分子進行擴增；一次復制一個堿基，然后檢測信號；最后運用高分辨率的分子成像排序系統。

應用高通量分子測序不僅為我們提供了豐富的分子遺傳學類信息，而且可以使每次測序的測量費用和排序時間大大縮短。技術的發展和進步使得這一方法變得更加可靠，絕大多數的轉錄表達(包括那些表達量極少的轉錄本)都能夠被精準地定量。隨著序列讀長的增加，454焦磷酸測序法的使用頻率將大增，進一步增加在非模式物種中鑒定基因的概率。

2.4.5 熒光定量PCR

在實時PCR熒光反應系統中首先添加了一個熒光團，將其與反應模板中的DNA混合后，進行了由高溫反應變性、低溫復性到適溫反應延伸的一系列反應過程，通過實時儀器檢測溫度不斷變化時的實時熒光反應信號并利用實時熒光反應信號分析來快速完成對各個起始反應模板的定量分析。此檢測技術的最大優點之處在于它可實時檢測PCR的起始擴增，并在起始擴增的每個指數檢測階段內可定量檢測起始擴增模板。

2.5 各種微生物的分離和鑒定研究結果

Xiong分析了泡菜發酵過程中乳酸菌群的變化；結果表明腸系膜乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和玉米乳桿菌等主導泡菜的發酵[18]。腸系膜乳桿菌在蔬菜腌制后立即出現在鹵水中，發酵過程中依次出現其他乳酸菌。乳酸主要發生在發酵初期，后期消失；腸系膜乳桿菌直到第5天才消失；玉米乳桿菌在中期存在，在第5.5天消失。植物乳桿菌和干酪乳桿菌主導了發酵的最后階段。

曾駿采用26S rDNA序列分析法鑒定從泡菜樣品中分離到的具有不同菌落特點的酵母菌。燕平梅等采用稀釋涂布的方法分離所研究泡菜中的微生物[19]。通過運用傳統微生物研究技術和16S rRNA基因對其進行鑒定，結果表明東北泡菜中乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用。另外，他們采用PCR-DGGE技術分析了泡菜中乳酸菌的多樣性[20]。

魏雯麗等利用宏基因組測序技術深入解析了抑制泡菜在乳酸菌發酵和培養過程中的活性微生物。結果表明Pediococcus，Lactobacillus，Starmerella，Weissella，Weisugiyamaella,Millerozyma是抑制泡菜在乳酸菌發酵和培養過程中的主要活性微生物菌屬[21]。呂嘉櫪等采用Illumina MiSeq高通量測序技術，分析研究了自然發酵泡菜的樣品的真菌群落結構多樣性[22]。泡菜中的絕對優勢菌群均為Ascomycota(子囊菌門)。而李恒等對泡菜研究結果表明，在泡菜發酵過程中，Ascomycota占絕對優勢，是泡菜中的主要真菌群類[23]。

裴樂樂等采用了構建16S rRNA基因文庫、18S rRNA基因文庫及23S rRNA的ARDRA分型方法進行分析，對4種以細菌為原料的不同四川泡菜樣品的分型進行了研究[24]。研究結果充分揭示了我國四川省生產泡菜的主要微生物來源的多樣性，反映了不同的原料制成四川省傳統泡菜的主要微生物來源群落的結構及其之間存在的差異性，為進一步深入探究傳統泡菜的主要發酵過程和機理、泡菜的風味影響因子的形成和機制以及我國傳統泡菜微生物在發酵過程中的工業化生產過程提供了一定的科學理論和基礎[25]。田偉等也采用了此研究方法來鑒別泡菜中所分離的乳酸菌類別[26]。

2.6 引起泡菜變質的腐敗微生物

2.6.1 腐敗微生物

在泡菜的發酵過程中，乳酸菌可以將發酵泡菜制作過程中原料中的某些營養物質迅速轉化為大量的養生風味營養物質和其他營養物質，如天然乳酸、氨基酸、維生素等，乳酸菌本身對發酵泡菜的這些營養風味物質功能破壞較小[27]。泡菜腐敗或者變質的原因是泡菜中有害微生物的嚴重污染。泡菜腐敗變質主要由酵母菌、霉菌和芽孢菌等微生物造成，這些腐敗微生物所引起的變質可以認為是泡菜汁液中的某種生物胺和其他微生物中的毒素等含量過高所導致。日常使用的泡菜食物中的某些蛋白質和糖分子在腐敗菌和其他微生物的光合作用下可以發生快速水解，分解后成為其中游離的各種氨基酸，然后使其脫落氨基并釋放出糖和氨。陳岑等近年研究發現蘇云金桿菌、G.candidum、解芽霉頭孢桿菌、C.xestobii等能夠直接引起各種泡菜不同品種程度的腐敗，是主要的腐敗有害微生物[28]。在泡菜中大量存在的亞丁酸菌、丁酸菌和腐敗菌能分解泡菜中的營養物質，使其產生刺激性惡臭味；大腸桿菌可以從泡菜中釋放出硫化氫和吲哚，這些都可使泡菜產生惡臭味，引起各類泡菜的腐敗和變質。

2.6.2 腐敗微生物的抑制

對泡菜發酵過程中的環境，如pH值、溫度、食鹽濃度、調味料的多少等進行控制，可以有效抑制腐敗微生物的生長繁殖。pH值在4.5以下可減少微生物對泡菜的影響，使泡菜不易腐敗變質；泡菜存放環境的溫度和光照也會影響腐敗微生物的生存和繁殖，陰涼避光的環境不適宜有害微生物的生存，適宜泡菜的保存。泡菜中所含的鹽分也對有害微生物有重要的影響，鹽分較高時會抑制微生物的生長，但不僅影響腐敗微生物也抑制了乳酸菌等的生長繁殖，而且影響泡菜的口感；當泡菜中所含鹽分較少時不能起到抑制微生物的作用，所以食鹽含量以4%為宜。姜、大蒜和鮮紅辣椒等添加進泡菜中都會有效降低一些泡菜香氣中的刺激性氣味化學物質，增加了一些泡菜的辛辣香氣并有效抑制了一些泡菜的腐敗，大蒜和鮮紅辣椒對多數酵母菌株具有較強的消化抑制殺菌作用，生姜則對少數有害菌株具有促進生長的作用，當其在泡菜中的濃度均值超過6%時會有效抑制有害微生物的正常生長。花椒對大多數酵母菌都具有促進生長的作用，對少數酵母菌也具有較明顯的抗菌抑制生長作用[29]，多酚也具有與上述花椒類似的抑制效果。

3 結論

關于泡菜微生物的研究和發展也存在著許多需要我們進一步思考和改進的問題：(1)目前關于泡菜發酵研究較多的是單批次發酵，對于多批次連續發酵的研究報道不多。(2)傳統自然發酵泡菜的菌群較多，對其風味品質影響較大，目前對泡菜中菌群結構多樣性研究較多的是以細菌為主，而對其中的真菌群落結構研究較少。(3)現在國內外關于各類泡菜食用微生物的相關研究主要集中在關于泡菜中多功能益生菌的有效篩選和推廣應用以及關于泡菜食物發酵利用過程中泡菜微生物的環境變化影響分析這兩個方面[30]。(4)最近由于DNA測序技術的普及，在探索這種微生物多樣性的研究中可以觀察到從基于文化的技術向基于測序的技術的轉變。雖然這些獨立于文化的技術有其自身的優勢，但對于新的與工業相關的菌株的選擇和鑒定來說，獲得物理分離物是必要的。(5)傳統上，采用變性梯度凝膠電泳、DGGE技術或16S rRNA基因的Sanger測序對微生物進行鑒定。最近，全基因組測序(WGS)隨著測序成本的降低而日益流行，與單個標記基因的測序相比，WGS獲得了更多關于感興趣菌株的信息。因此，要開發并使用更先進的計算分析，如利用WGS獲得基因組信息。雖然基于WGS的識別方法比傳統方法花費更高，并且需要大量的生物信息學專業知識，但是能夠獲得基因組序列草稿或完整的基因組序列有助于探索分離微生物的功能潛力。泡菜中的微生物具有更高的易于培養的潛力，這樣可以更容易地操作和更深入地研究。