酶解法提取花生殼黃酮及其抗氧化性、抑菌性研究

杜蕾，谷令彪，位子昂，高會會，張光杰

(安陽工學院，河南 安陽 455000)

花生，又名長生果，一年生草本植物，在我國很多地區均有種植，是重要的油料作物和經濟作物。近幾年，我國花生年均產量可達1700萬噸以上，與此同時也會產生大量的花生殼等加工副產物?；ㄉ鷼ぶ亓空蓟ㄉ傊氐?0%左右，其中不僅含有豐富的木質素和纖維素，少量淀粉、蛋白質等成分，還含有木犀草素、5,7-二羥基色原酮、圣草酚等多種黃酮類物質[1-2]。

黃酮類物質廣泛存在于植物的根、莖、葉、花及果實中，且種類多，結構復雜，以C6-C3-C6為基本骨架見圖1，是在A、B、C環上連接不同的取代基而形成的一組化合物。黃酮類物質具有抑菌、消炎、清除自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、增強免疫力等生物活性，是中草藥的重要成分[3-7]。從植物中提取出的黃酮類物質具有明顯的抗氧化性及抑菌性，可以將其應用于肉制品及乳制品的保鮮[8-9]。黃酮類物質除作為食品保鮮劑外，還可以將其用來開發調味品[10-11]。

圖1 黃酮類物質的C6-C3-C6骨架結構

目前，花生殼并沒有得到很好的開發利用，絕大部分花生殼被焚燒或丟棄，只有少部分被制成飼料，造成了花生殼資源的大量浪費，而且會危害環境。本研究以花生殼為原料，利用纖維素酶來輔助提取其中的黃酮類物質，并進行抗氧化及抑菌試驗，以期為其在食品、醫藥、化工等領域的應用提供理論依據。對農產品加工副產物進行綜合利用不但是對農產品廢棄物高效轉化的一種體現，還可以獲得良好的經濟效益及社會效益，對我國相關產業的發展也具有深遠影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生：購于河南安陽某市場，手工剝殼；蘆丁標準品：上海哈靈生物科技有限公司；纖維素酶(10 U/mg)：深圳綠微康生物科技有限公司；2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基(DPPH)：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸(Vc)：國藥集團化學試劑有限公司；AB-8大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌：由安陽工學院生物與食品工程學院微生物實驗室提供；其他化學試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW-400A粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；TD02D電子分析天平 余姚市金諾天平儀器有限公司；201D旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；T9紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HH8臺式低速大容量離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；L550數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；HL-2F恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司； STELLAR 85真空冷凍干燥機 美國Millrock公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；TM-XD50D臺式快速蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 提取方法

篩選出外觀完好的花生殼，洗凈，干燥，粉碎，過60目篩，備用。向250 mL具塞三角瓶中加入5 g花生殼粉、一定量的纖維素酶、體積分數70%的乙醇水溶液，置于恒溫水浴中進行酶解提取，冷卻至室溫后進行過濾。收集濾液，經離心機轉速4000 r/min離心10 min，收集上清液，測定黃酮的提取率。

1.4 提取率的計算

以蘆丁標準品來繪制標準曲線[12]，得線性回歸方程為：y=3.5022x+0.0055(R2=0.9967)。

將提取到的上清液置于100 mL的容量瓶中，用70%乙醇定容，取5 mL于25 mL的容量瓶中，按標準曲線的方法測定花生殼黃酮的提取率，公式如下：

式中：R為花生殼黃酮的提取率，%；m為花生殼質量，g；c為測得黃酮濃度，mg/mL；v為樣品溶液體積，mL；n為溶液稀釋倍數。

1.5 單因素及正交試驗

以黃酮提取率為響應值，分別選擇酶添加量(0.4%～1.4%，占花生殼的質量)、酶解時間(60～180 min)、酶解溫度(35～65 ℃)、料液比(1∶4～1∶14，g/mL)進行單因素試驗，以單因素試驗結果來設計四因素三水平正交試驗，優化黃酮提取工藝，以獲得最佳工藝參數。

1.6 大孔樹脂純化

AB-8大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h后，用蒸餾水沖洗至無乙醇味，加入層析柱中?；ㄉ鷼S酮提取液經旋轉蒸發儀40 ℃，200 r/min進行減壓濃縮，濃縮液加蒸餾水稀釋至2 mg/mL，設置恒流泵轉速45 r/min，流速1.42 mL/min，上樣量2.5倍樹脂體積；5倍樹脂體積蒸餾水進行洗滌后，4倍樹脂體積70%乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液減壓蒸餾，得到濃縮液備用。

將1.3和1.6得到的濃縮液置于真空冷凍干燥機內，冷凍條件：-40 ℃、10 h，-60 ℃、26 h；干燥條件：10 ℃、28 h，20 ℃、20 h，真空度100 mt，分別得到花生殼黃酮粗提物、純化后花生殼黃酮。

1.7 抗氧化試驗

取純化后的花生殼黃酮，用70%乙醇配制成5 mg/mL的樣品溶液，再梯度稀釋成不同濃度的花生殼黃酮溶液(1，2，3，4，5 mg/mL)，測定其對羥基自由基和DPPH自由基的清除作用，以70%乙醇作陰性對照，相同濃度的Vc溶液作陽性對照。

1.8 抑菌試驗

1.8.1 抑菌試驗

采用濾紙片法對花生殼黃酮的抑菌性進行測定[13]。配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，滅菌，備用；在超凈工作臺上，采用劃線法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌接種至斜面培養基上，置于37 ℃培養箱中培養24 h，備用；分別用無菌水對斜面培養基上的4種細菌進行稀釋，得到菌體濃度為106個/mL的菌懸液，備用；取純化后的花生殼黃酮，用無菌水配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL的樣品溶液，取直徑為6 mm的圓形濾紙片，高壓滅菌后放入不同濃度樣品溶液中浸泡1 h，備用；分別向平板培養基上加入0.5 mL的菌懸液，并涂布均勻，將浸濕的濾紙片貼在平板表面，置于恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑，重復3次取平均值，以生理鹽水作為陰性對照。

1.8.2 最小抑菌濃度(MIC)試驗

取純化后的花生殼黃酮，用無菌水溶解后，加入無菌培養基中，使其在培養基中的濃度分別為0.50，0.75，1.00，1.25 mg/mL，倒入培養皿，凝固后，分別加入金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌各100 μL，涂布均勻，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，肉眼觀察是否有可見菌。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶添加量對提取率的影響

固定料液比1∶8、酶解時間150 min、酶解溫度50 ℃，考察酶添加量對黃酮提取率的影響，結果見圖2。

圖2 酶添加量對提取率的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增大，黃酮提取率也逐漸增大，在酶添加量達到1.0%時，提取率為2.378%，此后再增大酶添加量，提取率并沒有明顯提高?；ㄉ鷼ぷ鳛榈孜?，濃度是固定的，當增加纖維素酶的用量時，酶的濃度被提高，加速了酶與底物的反應速度，促進了細胞破裂，從而使黃酮類物質溶出，提取率提高；當酶的濃度達到飽和時，反應速度達到平衡，再增加酶的用量也不會明顯地提高提取率。

2.1.2 酶解時間對提取率的影響

固定酶添加量1.0%、料液比1∶8、酶解溫度50 ℃，考察酶解時間對黃酮提取率的影響，結果見圖3。

圖3 酶解時間對提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，花生殼黃酮提取率明顯提高，當酶解時間為90 min時，提取率為2.403%，此后再延長酶解時間，提取率反而有所下降。在反應初期，延長酶解時間可以使酶與底物之間的反應充分進行，提高黃酮提取率；在反應完成以后，酶逐漸失去活性，長時間的作用也可能導致黃酮結構被破壞，降低了提取率。

2.1.3 酶解溫度對提取率的影響

固定酶添加量1.0%、料液比1∶8、酶解時間90 min，考察酶解溫度對黃酮提取率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解溫度對提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，黃酮提取率變化明顯，在35～45 ℃時，提取率隨著溫度的升高而增大，在45 ℃時達到最大，為2.495%。當溫度超過45 ℃后，隨著溫度的持續增大，黃酮提取率卻開始下降。酶活性受溫度的影響較大，酶可以在短時間內耐受較高的溫度，而當反應時間較長時，最適溫度會向溫度降低的方向移動。在實際應用中，應根據酶促反應作用時間的長短，選定不同的最適溫度。

2.1.4 料液比對提取率的影響

固定酶添加量1.0%、酶解時間90 min、酶解溫度45 ℃，考察料液比對黃酮提取率的影響，結果見圖5。

圖5 料液比對提取率的影響

由圖5可知，隨著料液比的改變，黃酮提取率發生變化明顯，在料液比為1∶4～1∶8時，黃酮提取率隨提取液的增加而提高，當料液比為1∶10時，提取率達到最大值2.576%，之后再增加提取液提取率反而下降。提取液的添加量會直接影響到酶和底物的濃度，提取液過少時，酶和底物接觸不充分，提取液過多又會稀釋酶和底物的濃度，只有當酶和底物的濃度達到理想值時，反應才能充分進行。

2.2 正交試驗

酶解法提取花生殼黃酮的正交試驗設計和結果見表1和表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交組合及試驗結果

由表2可知，RC>RA>RD>RB，即4個因素對提取率的影響主次順序依次為酶解溫度>酶添加量>料液比>酶解時間。各因素最優組合為A2B3C2D2，經驗證最佳工藝條件是：酶添加量1.0%、酶解時間120 min、酶解溫度45 ℃、料液比1∶10，在此條件下進行花生殼黃酮的提取試驗，最終提取率可達到2.593%。

2.3 大孔樹脂純化

對正交試驗得到的最佳工藝進行提取，對比純化前后提取物中黃酮的含量，發現花生殼黃酮提取物經AB-8大孔樹脂純化后，其黃酮含量由12.71%提高到25.32%。

2.4 抗氧化性試驗

2.4.1 對羥基自由基的清除作用

花生殼黃酮對羥基自由基的清除作用見圖6。

圖6 黃酮對羥基自由基的清除率

由圖6可知，隨著黃酮濃度的增加，花生殼黃酮對羥基自由基的清除效果增強，在相同濃度下，黃酮對羥基自由基的清除能力均高于Vc；在濃度為5 mg/mL時，對羥基自由基的清除率為84.5%。

2.4.2 對DPPH自由基的清除能力

花生殼黃酮對DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 黃酮對DPPH自由基的清除率

2.5 抑菌性試驗

花生殼黃酮的抑菌作用見表3，最小抑菌濃度見表4。

表3 花生殼黃酮的抑菌作用Table 3 The antibacterial effect of flavonoids from peanut shells

表4 花生殼黃酮最小抑菌濃度(MIC)

由表3和表4可知，隨著花生殼黃酮濃度的增大，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯增強，濃度為1.25 mg/mL時對這4種細菌均有明顯的抑制作用，花生殼黃酮對4種細菌的MIC分別為金黃色葡萄球菌1.00 mg/mL、大腸桿菌1.25 mg/mL、沙門氏菌0.75 mg/mL、枯草芽孢桿菌1.00 mg/mL。

3 結論

黃酮類物質多存在于植物細胞中，纖維素是構成細胞壁的主要成分，通過添加纖維素酶可以破壞細胞壁結構，加速細胞內物質的溶出速度。本試驗在單因素試驗的基礎上，進行酶添加量、酶解時間、酶解溫度、料液比四因素三水平的正交試驗，得到花生殼黃酮最佳提取工藝為：酶添加量1.0%、酶解時間120 min、酶解溫度45 ℃、料液比1∶10，在此條件下花生殼黃酮的提取率可達到2.593%。

機體內存在大量自由基會加速衰老和疾病的產生，黃酮類物質所含的酚羥基可以與自由基結合，終止氧化鏈式反應，起到抗氧化的作用。本試驗通過對羥基自由基和DPPH自由基的清除效果來測定花生殼黃酮的抗氧化性，結果表明花生殼黃酮對羥基自由基和DPPH自由基的清除率與其濃度呈正相關；在相同濃度下，其清除能力均高于Vc。

黃酮類物質的抑菌性與其骨架結構上連接的羥基位置和數量有關，抑菌機理主要包括破壞菌體細胞結構、抑制菌體內酶的活性、抑制菌體內物質及能力的代謝等作用。抑菌性試驗表明花生殼黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌都有較好的抑制作用，且抑菌效果與其濃度呈正相關；最小抑菌濃度試驗表明在濃度達到1.25 mg/mL時，對以上4種細菌即可表現出明顯的抑制作用。

我們可以利用花生殼黃酮的抗氧化性和抑菌性，將其應用于食品、化妝品、醫藥等領域。目前，國內外關于黃酮類物質作為食品保鮮劑的報道比較多，但將其應用于調味品的研究還比較少見。近年來，人們對調味品的要求不僅僅是要滿足味蕾的需求，還要求其更加營養、安全、健康，因此，營養調味品、功能調味品等復合調味品具有廣闊的市場前景[14]。黃酮類物質作為天然功能性成分雖然健康、安全、無副作用，但其穩定性不如化學合成物質，因此，可以利用微膠囊等技術來減少其營養成分的損失，延長貨架期，擴大其在調味品中的應用范圍[15]。