Pitx2對缺氧誘導的心肌細胞H9c2凋亡的影響

王大強，王革新，薛士鵬，張慶遠，杜碧麗

近年來，我國冠心病等心血管疾病發病率呈升高趨勢，目前藥物治療多數是通過擴張血管、抗凝、改善心肌重塑等改善心肌缺血，通過介入治療、溶栓等促進血液流通，延長心肌細胞生存時間，恢復心肌功能，但由于心肌細胞防御功能未發揮或自身存在抵抗作用，較多病人治療后療效不佳[1]。有研究顯示，通過基因手段可改善心肌細胞適應能力，減少由缺血引起的細胞凋亡，抑制心肌損傷，可能為預防和治療心肌缺血研究的方向[2]。

Pitx2基因全名為paried-like homodmain transcription factor 2，其定位于4q25-26染色體上，Pitx2屬于Bicoid家族成員，是一個轉錄因子，Pitx2和Pitx1、Pitx3共同構成了Pitx亞家族[3]。有研究表明，Pitx2在胚胎發育的眼睛周圍、臍帶、上下頜區域及四肢基部等部位表達，成人舌、腦、肺、腎等器官中也有Pitx2表達，Pitx2與左右不對稱發育有關[4]。Pitx2突變引起多種疾病，如青光眼、角膜環狀皮樣瘤、乳腺癌等[5-7]。相關研究顯示，Pitx2與心臟發育有關，敲除Pitx2可誘發小鼠心臟出現脂肪樣組織，而獲得Pitx2小鼠可免受缺血性心肌細胞損傷[8]。Pitx2缺陷的小鼠心尖部切除后不能及時修復，而增強Pitx2之后的小鼠心肌梗死后心肌組織再生能力明顯增強，Pitx2具有保護心臟、促進心臟修復的作用[9]。目前關于Pitx2在缺氧誘導心肌細胞凋亡中的作用尚不明確。本研究以心肌細胞H9c2作為研究對象，探討Pitx2對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的影響及作用機制，以期為基因治療和改善心肌缺血提供可能思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C-Caspase-3抗體、Pitx2抗體購自美國Abcam公司；Pitx2過表達載體、C/EBP同源蛋白(CHOP)過表達載體、陰性對照載體均由普健生物(武漢)科技有限公司提供；CHOP抗體、C-Caspase-12抗體購自美國Proteintech公司；心肌細胞H9c2購自通派(上海)生物科技有限公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特；MR-96A酶標儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.2 細胞分組 心肌細胞培養條件為37 ℃，飽和濕度，5%CO2培養箱，細胞培養在添加10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，細胞傳代培養以0.25%的胰蛋白酶消化進行傳代培養。將心肌細胞分為4組，對照組：常規條件培養，為空白對照細胞；模型組：在實驗開始時，進行缺氧復氧處理；Vector組：實驗開始前24 h在細胞中轉染陰性對照載體，實驗開始時給予缺氧復氧處理；Pitx2組：實驗開始前24 h在細胞中轉染Pitx2過表達載體，實驗開始時給予缺氧復氧處理。缺氧復氧處理方法：將細胞置于含有5%CO2、1%O2的37 ℃培養箱內培養。細胞轉染方法按照脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000操作說明進行。

1.3 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測Pitx2 mRNA 收集1.2方法處理24 h后的對照組、模型組、Vector組和Pitx2組細胞，將孔中的上清溶液棄掉后，吸取磷酸緩沖鹽溶液(PBS)反復洗滌細胞2次，在細胞內添加Trizol試劑，常規方法提取細胞總RNA。冰浴條件下的EP管中添加1 μL的oligo dT、1 μL的random，添加ddH2O至12.5 μL，置于70 ℃孵育5 min后，置于冰上冷卻2 min，之后再加入2 μL的dNTP、4 μL的5×Buffer、0.5 μL的RNasin、1 μL的M-MLV，均勻混合后，置于25 ℃溫浴10 min，42 ℃溫浴50 min，之后置于80 ℃孵育10 min，冰上冷卻，得到的cDNA置于-20 ℃保存。PCR反應體系：1 μL的cDNA、10 μL的SYBR Green mastermix、0.5 μL的正向、反向引物，添加ddH2O至20 μL，PCR反應條件：94 ℃孵育5 min，94 ℃孵育10 s，60 ℃孵育20 s，72 ℃孵育30 s，共進行40個循環。Pitx2正向引物為5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3′，反向引物為5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3′。

1.4 免疫印跡法檢測Pitx2蛋白 收集1.2方法處理24 h后的對照組、模型組、Vector組和Pitx2組細胞，將孔中的上清溶液棄掉后，吸取PBS反復洗滌細胞2次，之后在細胞內添加放射免疫沉淀(RIPA)裂解溶液，晃動細胞培養板使裂解液完全覆蓋細胞，置于冰上裂解20 min，期間采用移液槍吹打細胞4次。吸取裂解溶液并轉移到離心管內，置于4 ℃低溫離心機中，以12 000 g離心10 min。吸取上清溶液，分裝并保存。采用2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)方法測定提取蛋白濃度。使用濾紙將洗凈的玻璃板吸干，干燥后常規方法組裝。使用濃度分別為10%分離膠和5%分離膠進行SDS-PAGE電泳，在蛋白中加入5×上樣緩沖溶液，置于沸水浴中孵育5 min，制備成上樣液。每個孔添加20 μL的上樣液(含有30 μg蛋白)，連接電源，以80 V的恒定電壓持續電泳3 h。電泳即將結束時，將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜提前浸泡在轉移緩沖液中，按照“三明治”方法進行轉膜，轉膜電壓調整為60 V，轉膜進行1.5 h。將PVDF膜置于5%牛血清白蛋白溶液中，在室溫下搖床震蕩反應1 h。一抗和二抗使用前以封閉液稀釋，Pitx2抗體按照1∶600稀釋，內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體按照1∶1 000稀釋，二抗按照1∶2 000稀釋。將PVDF膜置于一抗孵育袋中，在室溫中孵育結合2 h，之后將PVDF膜置于二抗孵育袋中，在室溫中結合2 h。將提前混合好的電化學發光(ECL)試劑A和B混合物滴加到PVDF膜上，靜置5 min。采用Image J分析條帶的灰度值。Pitx2蛋白相對表達=Pitx2條帶灰度值/GAPDH灰度值。

1.5 四唑鹽(MTT)測定細胞增殖情況 將對照組、模型組、Vector組和Pitx2組心肌細胞按照每個孔4×103個細胞接種到96孔板內，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養24 h。將培養箱取出，在每個孔內添加10 μL的MTT工作液，37 ℃孵育4 h。吸取孔內液體，再添加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，使用酶標儀測定每個孔OD值。細胞存活率=(對照組OD值/實驗組OD值)×100%。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 收集按照1.2方法處理24 h后的對照組、模型組、Vector組和Pitx2組細胞，將孔中上清溶液棄掉后，吸取PBS反復洗滌細胞2次，添加胰蛋白酶，置于37 ℃消化1 min，1 000 g離心10 min，采用PBS將細胞懸浮，將細胞濃度調整至1×106個/mL。吸取1 mL細胞培養液，離心后取細胞沉淀，添加400 μL的結合緩沖溶液，之后再吸取5 μL的Annexin V-FITC和PI染色液添加到細胞內，避光條件下結合15 min。采用流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.7 免疫印跡法檢測C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP蛋白表達 收集1.2方法處理24 h后的對照組、模型組、Vector組和Pitx2組細胞，按照1.4中免疫印跡法步驟檢測C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP蛋白表達，C-Caspase-3、C-Caspase-12抗體按照1∶200稀釋，CHOP抗體按照1∶400稀釋。

1.8 CHOP過表達載體對上調Pitx2影響心肌細胞作用的測定 采用Lipofectamine 2000分別將CHOP過表達載體、Pitx2過表達載體和陰性對照載體、Pitx2過表達載體共轉染到心肌細胞內，之后給予缺氧處理，作為Pitx2+CHOP組、Pitx2+NC組。細胞培養24 h后，MTT方法檢測增殖細胞(步驟參照1.5)，流式細胞術檢測凋亡細胞(步驟參照1.6)，免疫印跡法檢測C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP蛋白表達(步驟參照1.7)。

2 結 果

2.1 Pitx2過表達載體對缺氧誘導的心肌細胞中Pitx2表達的影響 與對照組比較，模型組心肌細胞Pitx2 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)；與Vector組比較，Pitx2組心肌細胞Pitx2 mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05)。提示Pitx2過表達載體提高缺氧條件下心肌細胞中Pitx2表達水平。詳見圖1、表1。

圖1 Pitx2過表達載體轉染后缺氧誘導的心肌細胞中Pitx2蛋白表達條帶圖

表1 Pitx2過表達載體轉染后缺氧誘導的心肌細胞中Pitx2 mRNA和蛋白水平(±s)

2.2 上調Pitx2對缺氧誘導的心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組心肌細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，細胞C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達水平均提高(P<0.05)；與Vector組比較，Pitx2組心肌細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，細胞C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達水平均降低(P<0.05)。提示上調Pitx2可提高缺氧條件下心肌細胞增殖能力，減少細胞凋亡。詳見圖2、表2。

圖2 上調Pitx2對缺氧誘導的心肌細胞凋亡和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達的影響(A為心肌細胞凋亡的流式細胞圖；B為C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達條帶圖)

表2 上調Pitx2后缺氧誘導的心肌細胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達水平比較(±s)

2.3 上調Pitx2對缺氧誘導的心肌細胞內質網應激相關蛋白CHOP表達影響 與對照組比較，模型組心肌細胞CHOP蛋白表達水平增高(P<0.05)；與Vector組比較，Pitx2組心肌細胞CHOP蛋白表達水平降低(P<0.05)。提示上調Pitx2抑制缺氧條件下心肌細胞CHOP表達。詳見圖3、表3。

圖3 上調Pitx2對缺氧誘導的心肌細胞中CHOP蛋白表達影響的條帶圖

表3 上調Pitx2后缺氧誘導的心肌細胞CHOP蛋白水平比較(±s)

2.4 CHOP過表達載體對上調Pitx2的缺氧心肌細胞CHOP蛋白表達的影響 與Pitx2+NC組比較，Pitx2+CHOP組心肌細胞CHOP蛋白表達水平升高(P<0.001)。提示CHOP過表達載體促進Pitx2缺氧心肌細胞CHOP蛋白表達。詳見圖4、表4。

圖4 CHOP和Pitx2過表達載體共轉染對缺氧誘導的心肌細胞CHOP蛋白表達影響的條帶圖

表4 CHOP和Pitx2過表達載體共轉染后缺氧誘導的心肌細胞CHOP蛋白水平比較(±s)

2.5 CHOP對上調Pitx2的缺氧心肌細胞增殖和凋亡影響 與Pitx2+NC組比較，Pitx2+CHOP組心肌細胞存活率降低，凋亡率升高，C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達增多(P<0.001)。提示上調CHOP可逆轉Pitx2的保護作用。詳見圖5、表5。

圖5 CHOP和Pitx2過表達載體共轉染對缺氧誘導的心肌細胞凋亡和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達的影響(A為心肌細胞凋亡檢測的流式細胞圖；B為C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表達的條帶圖)

表5 CHOP和Pitx2過表達載體共轉染后缺氧誘導的心肌細胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白水平比較(±s)

3 討 論

缺血性心臟病是臨床常見的心血管系統疾病，缺血條件下，心肌細胞增殖能力降低，細胞凋亡增加，導致心肌組織完整性受損，引起心肌損傷，體外缺氧心肌細胞模型是常見的缺血心肌損傷的研究模型。缺氧條件下，細胞增殖能力降低，細胞凋亡水平升高[10]。本研究結果顯示，缺氧處理后的心肌細胞存活率降低，細胞凋亡率增高，說明成功構建了缺氧心肌細胞損傷模型。

Pitx2是一種重要的轉錄因子，是Pitx家族中的成員之一[11]。Pitx2蛋白是同源域蛋白中與二倍體有關的一種亞類，Pitx2氨基酸殘基在第三螺旋的第9個位置，在DNA和RNA結合中發揮著決定性作用，C端高度保守[12]。轉錄因子Pitx2在不同的物種中均有表達，與眼畸形、心血管畸形、垂體異常畸形等有關，在心臟、四肢、眼睛等器官發育中發揮著關鍵作用[13]。缺失Pitx2的小鼠出現明顯的右心房異構且靜脈回流受阻，肺組織及竇房結發育受到嚴重損害[8-9，14]。Pitx2功能增加后的成年小鼠心肌細胞心肌梗死后可再生[8]。敲除Pitx2后的小鼠出現心肌梗死，而恢復Pitx2可有效緩解成熟的心肌細胞免受缺血損傷[9]。Pitx2在心肌組織中發揮保護作用。本研究結果顯示，缺氧處理后的心肌細胞Pitx2表達水平下調，而上調Pitx2可提高缺氧條件下心肌細胞增殖能力，減少細胞凋亡，表明Pitx2具有抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡作用，證實了Pitx2在缺氧心肌細胞中的作用。本研究結果與上述研究結果一致，說明Pitx2可能具有保護心肌組織缺氧損傷的作用。

缺氧誘導心肌細胞凋亡是造成缺血性心肌組織損傷的重要原因[15]。有研究表明，內質網應激在缺氧心肌細胞凋亡中發揮著作用[16]。內質網存在于真核細胞內，是與蛋白質折疊、應激反應等有關的細胞器之一，對缺氧、缺血、葡萄糖、ATP耗竭等應激刺激的敏感程度較高，一定程度的內質網應激可以改善內質網功能，而長時間、高強度的內質網應激則誘導細胞凋亡，導致組織損傷發生[17]。介導內質網應激細胞凋亡的關鍵調節因子之一為CHOP。CHOP是內質網應激中的轉錄因子，是堿性亮氨酸鋅指結構蛋白樣轉錄因子家族中的重要成員之一，在哺乳動物體內廣泛存在[18]。機體受到外界因素刺激后，CHOP表達水平增加，內質網應激水平升高，CHOP又可激活Caspase-12，進而誘導Caspase級聯反應發生，最終促進凋亡執行因子Caspase-3活化，促進細胞凋亡發生[19-20]。Caspase是與細胞凋亡有關的蛋白家族，其含有多個蛋白成員，分別位于Caspase凋亡反應的上游、中游和下游[21]。Caspase-12和Caspase-3均屬于Caspase蛋白家族成員，在正常情況下多以無活性形式存在，只有被激活后形成C-Caspase-12、C-Caspase-3可誘導細胞凋亡的發生[22-23]。本研究結果顯示，缺氧促進心肌細胞表達C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP，而上調Pitx2抑制C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白表達，說明上調Pitx2可激活缺氧條件下心肌細胞中內質網凋亡途徑。同時結果顯示，上調CHOP可逆轉Pitx2的保護作用，證實了上調Pitx2影響心肌細胞凋亡，與CHOP有關。

綜上所述，Pitx2在缺氧誘導的心肌細胞凋亡中發揮著保護作用，Pitx2在缺血性心肌損傷中可能發揮抑制功能，Pitx2的作用機制與影響CHOP調控內質網應激有關。本研究未詳細論述Pitx2通過何種直接或間接靶向機制影響CHOP表達，今后需進一步研究。