基于高效液相色譜-質譜聯用技術解析山欄稻營養品質的代謝物譜

張忠輝，鄧 淵，強 奇，陳日東，楊 君，劉賢青，王守創，袁潛華，羅 杰，羅越華

（海南大學 熱帶作物學院/海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228）

山欄稻（Oryza sativaL.），又稱山蘭稻，是海南地區黎、苗等少數民族經過長期種植和選擇培育出適合中部干旱地區種植的旱稻品種，是珍貴的旱稻種質資源[1-2]。山欄稻具有抗旱、耐熱、抗病、抗蟲等優良特性，食味品質性狀優異，其米飯味香色美，有“一家煮飯全村香”的美譽[3]。大多數山欄稻品種屬于熱帶粳稻型或偏粳稻型種質資源，籽粒飽滿、穎殼顏色、糙米顏色、有無芒等特征性狀均表現出山欄稻豐富的種質多樣性[4]。充分挖掘山欄稻種質資源，解析其種子中代謝物的種類和含量，是揭示山欄稻種子中營養品質形成機理的前提，對培育優質健康的新品種具有重要意義。代謝組學是繼基因組、轉錄組和蛋白組學之后發展起來的新興組學技術，是系統生物學重要的組成部分[5]。隨著質譜檢測技術的不斷發展，植物代謝組學的研究也進入快速發展階段。近年來，水稻（Oryza sativaL.）、玉米（Zea mays L.）、番茄（Solanum lycopersicum）等主要作物的營養品質代謝數據庫已經相繼建成，并且系統研究了作物中各種營養成分的種類、含量差異以及代謝合成途徑，這為深入研究作物營養品質代謝組的生化與遺傳機制奠定了基礎[6-8]。同時，王守創等[9]對柑橘、甜橙、柚子和檸檬等不同類型的木本科材料進行代謝譜分析，系統地研究了氨基酸等初生代謝物、類黃酮等次生代謝物的組織差異性和群體自然變異；陳偉等[10]發展了新的代謝檢測方法，并建立了包含近1 000 種營養物質的水稻代謝數據庫。有研究表明，決定水稻種子顏色差異的代謝物主要是類黃酮物質，如紅色稻米中富含原花青素類代謝物，而黑色和紫色稻米中主要包含糖基化的矢車菊素和芍藥花青素[11-12]。目前，關于山欄稻的研究方向主要集中在優質種質資源的收集和耐旱機理的研究，其營養成分的定性和定量分析，以及不同品種代謝譜的自然變異尚未報道。因此，本研究利用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術建立了山欄稻種子代謝數據庫，同時，還鑒定了一批用于篩選山欄稻優異種質資源的標記代謝物，旨在為山欄稻營養品質的改良提供優良親本和豐富水稻育種的種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料本研究選取的實驗材料均由海南大學熱帶作物學院生物多樣性與水稻種質創新實驗室提供，包括10 份山欄稻材料和5 份普通水稻（表1）。樣品采集：選取長勢一致、成熟期一致的水稻植株進行收種，每份材料選取12 株隨機分為3 個生物學重復。萌發試驗：選取SR50 和ZH11 的種子進行萌發，待種子露白后開始計時，分別選取24、48、72 h 的萌發種子進行代謝物檢測分析。

表1 本實驗的水稻品種信息Tab.1 Rice varieties and sources

1.2 樣品提取選取飽滿的水稻種子進行脫殼，分別將糙米和穎殼研磨成粉末。稱取0.1 g 粉末樣品，加入1.2 mLφ＝70%的甲醇渦旋均勻，放到4 ℃環境條件下萃取12 h 后進行離心（4 ℃，10 000 g，10 min）。吸取上清用0.22 μm 的濾頭過濾，濾液保存到進樣瓶中待測。MIX 樣品：從每個提取樣品溶液中吸取50 μL加入到進樣瓶中，混合均勻作為質控樣品，通過比較質控樣品的穩定性來反映檢測儀器的穩定性。

1.3 儀器檢測條件選取UPLC-Thermo Scientific Q EXACTIVE plus 系統中Full MS/dd-MS2的模式進行代謝物檢測。儀器：高效液相色譜（UltiMate 3000)-四級桿-Orbitrap（Q EXACTIVE plus）高分辨質譜（美國賽默飛世爾科技有限公司）。色譜條件：色譜柱為shim-pack VP-OSD（pore size 5.0 um）C18（日本島津公司），流動相為水（含φ＝0.04%乙酸）和乙腈（含φ＝0.04%乙酸）。洗脫梯度：V水∶V乙腈=95∶5，0 min；V水∶V乙腈=5∶95，10.0 min；V水∶V乙腈=5∶95，11.0 min；V水∶V乙腈=95∶5，11.1 min；V水∶V乙腈=95∶5，15.0 min。流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量為1 μL。質譜條件：HESI（可加熱電噴霧離子源）；正離子模式；鞘氣輔助流速比例為40；輔助氣流速比例為12；噴霧電壓3 000 V；毛細管溫度360 ℃；Slens 電壓55.0 V；輔助氣加熱溫度350 ℃；離子掃描范圍m/z50～1 500。

1.4 數據處理利用Compound discover（Compound Discover3.1.0.305，Thermo）軟件對檢測數據進行定量分析。首先，在軟件中創建新的定量分析方法，導入原始的下機數據，根據樣品類型對檢測數據進行分類，最后，選擇合適的工作流（workflow），調整相應參數進行定量和定性分析。主要參數設置如下：前體離子掃描范圍0～5 000 Da，信噪比閾值大于1.5 S/N (signal to noise) Threshold >1.5,質量公差（mass tolerance）5×10-6最大轉換時間（Maximum shift ）2 min，最小峰強度（Min peak intensity）106，洗脫時間（RT）的誤差范圍在0.1 min。并且利用檢測樣品相對定量的原始數據進行主成分分析（principle component analysis,PCA）。利用SPSS 軟件對差異數據進行獨立樣本t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 山欄稻與普通水稻種子的非靶向代謝組分析為了探究山欄稻和普通水稻種子間代謝物譜的差異，筆者利用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術對山欄稻和普通水稻種子的不同組織混合樣品進行非靶向代謝組分析。首先，分別提取4 個混合樣品的總離子色譜圖（TIC total ion chromatogram）進行比較分析，結果顯示（圖1），山欄稻和普通水稻的糙米代謝譜TIC 圖形相似，只有部分代謝信號的強度存在差異（圖1-A）；而穎殼間的代謝譜存在顯著差異，部分代謝信號只有在山欄稻的穎殼組織中出現（圖1-B）。結果表明，在糙米和穎殼2 種組織中，山欄稻和普通水稻的代謝物種類和含量都存在顯著差異，其中二者的穎殼代謝譜差異最顯著。

圖1 山欄稻和普通稻種子的代謝譜比較分析A、B：為水稻種子的糙米(A)和穎殼(B)非靶向代謝組檢測的總離子流色譜圖，其中，綠色的代表普通水稻，紅色的代表山欄稻；C、D：是水稻種子的糙米(C)和穎殼(D)代謝組的主成分分析。Fig.1 Comparative analysis of the metabolic profile of the seeds of Shanlan upland rice and conventional riceA,B:The total ion chromatogram of non-targeted metabolome detection of brown rice (A) and glume shell (B) of rice seeds.The green represents conventional rice and the red represents Shanlan upland rice;C,D:Principal component analysis of the metabolome of brown rice (C) and glume shell (D) of the rice seeds.

為了解析山欄稻和普通水稻的代謝譜差異是由那些代謝物導致，筆者對10 份山欄稻和5 份普通水稻種子的糙米和穎殼進行非靶向代謝組分析，然后通過Compound discover 軟件對所檢測的原始數據進行主成分分析（principal component analysis,PCA）。從圖1-C 可知，被檢測的所有糙米樣品明顯的聚為2 個分組，其中，第1 主成分方向特征值占總方差值的8.0%，第2 主成分方向特征值占總方差值的7.6%，說明山欄稻和普通水稻的糙米組織的代謝組存在顯著差異。進一步分析所有代謝信號的貢獻率，發現氨基酸、脂質和類黃酮等物質的貢獻值較高（表2），這些代謝物決定了山欄稻和普通水稻的營養成分存在差異。在不同類型的穎殼樣品中也得到了類似的結果，山欄稻和普通水稻可以分為2 個明顯的區域，其中，類黃酮和有機酸類物質貢獻值比較高（表3），它們可能是影響山欄稻和普通水稻穎殼代謝差異的主要代謝物(圖1-D)。水稻種子的非靶向代謝組結果表明，山欄稻和普通水稻種子的代謝組存在顯著的差異，并且二者的營養成分也有明顯的不同。

表2 山欄稻糙米中部分代謝物的貢獻率Tab.2 Contribution rate of some metabolites in the brown rice of Shanlan upland rice

表3 山欄稻穎殼中部分代謝物的貢獻率Tab.3 Contribution rate of some metabolites in the glume shell of Shanlan upland rice

2.2 山欄稻種子代謝數據庫的建立為了建立山欄稻種子代謝數據庫，對山欄稻種子高分辨質譜數據進行提取，共獲得6 809 個原始質譜信號。經過冗余信號的去重、峰型篩選，最終獲得1 058 個高質量的代謝信號。首先，利用標準品比對的方法進行物質鑒定，采用相同檢測條件獲取標準品數據包括洗脫時間（retention time,RT）、[M+H]+精確荷質比（m/z）和二級質譜碎片信息。代謝信號（metabolite rice,mr）mr1008 的質荷比為303.042 2，RT 為5.20 min，與槲皮素的質荷比和RT 一致。通過比較二者的二級質譜碎片信息，發現mr1 008 包含285、257、229、153、137 和121 等碎片與槲皮素的碎片信息基本一致。其中特征碎片153 和257 的響應強度較高，分別為1.86×105和8.96×104，故鑒定該物質為槲皮素。在鑒定過程中發現mr690 的質荷比為639.195 7 與Tricin 7-O-neohesperidoside 的質荷比639.191 9 基本一致，RT 均為4.28 min。mr690 的母離子丟失2 種類型的糖基碎片（五碳糖：146 Da，六碳糖：162 Da），形成493 和331 等特征碎片，其碎片強度分別2×106和7×106。由于mr690 的m/z、RT 以及質譜裂解規律與Tricin 7-O-neohesperidoside 一致，故鑒定mr690 為Tricin 7-O-neohesperidoside。本研究通過標準品比對的方法共鑒定到126 個代謝物。

圖2 為亞麻酸乙酯的鑒定過程，在人工解譜的過程中，發現mr220 的m/z為307.262 4，分子式為C20H34O2，與亞麻酸乙酯的m/z307.263 1 相近，RT 為9.76 min，故推斷該物質可能為亞麻酸類物質（圖2-A）。在mr220 的二級質譜碎片中包含261、243、123、95、67 等碎片信息，其中，261 碎片的產生說明mr220 的結構式中包含酯鍵（圖2-B），mr220 物質的碎片信息與亞麻酸乙酯推斷的斷裂碎片相一致，故鑒定該物質為亞麻酸乙酯（圖2-C）。通過人工解譜的方式，本研究共鑒定到519 個代謝物。本研究成功構建了包含1 058 個代謝信號的山欄稻種子代謝數據庫，其中645 個（61%）的代謝信號被注釋，413 個（39%）代謝信號未被注釋，注釋的代謝物中涵蓋了氨基酸、脂質、有機酸、維生素和類黃酮等多種代謝物，其中，與營養品質相關的代謝物如氨基酸、脂質、類黃酮所占比例較高，分別為12%、6%和4%（圖2-D）。

圖2 亞麻酸乙酯的鑒定和解析A：mr220 在9.76 min 時的色譜圖；B：mr220 的二級質譜碎片信息；C：亞麻酸乙酯的結構式及可能斷裂的位置；D：山欄稻種子代謝數據庫的物質組成。Fig.2 Identification and analysis of ethyl linolenateA:Chromatogram of mr220 at 9.76 min;B:MS-MS2 fragment information of mr220;C:Structural formula of ethyl linolenic acid and possible fracture location;D:The metabolite composition of the Shanlan upland rice seed in the metabolism database.

2.3 山欄稻和普通水稻種子中營養品質的代謝差異從圖3 可知：普通水稻與山欄稻種子間氨基酸總相對含量存在顯著差異，普通水稻種子中氨基酸含量普遍高于山欄稻（圖3-A），其中，脯氨酸和天冬氨酸的相對含量顯著高于山欄稻，分別是山欄稻種子中含量的2.6 倍和1.4 倍；山欄稻種子中僅脯氨酸、酪氨酸和還原型谷胱甘肽的相對含量高于普通水稻，其中谷胱甘肽的相對含量是普通水稻種子中含量的1.2 倍（圖3-B，圖3-C），說明山欄稻種子中僅部分氨基酸類物質含量高于普通水稻。

圖3 山欄稻與普通水稻種子間營養物質含量的差異A：種子中氨基酸類物質總量；B：種子中脯氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸和酪氨酸的含量差異；C：種子中谷胱甘肽的含量差異；D：種子中不飽和脂肪酸（左側）和甘油磷脂（右側）類物質總含量；E：種子中亞麻酸乙酯和ETE 的含量差異；F：種子中甘油磷脂的含量差異；G：種子中維生素類物質的含量差異；H：種子中黃酮類物質總量；I：種子中碳黃酮和氧黃酮的含量比例。*：P<0.05；**：P<0.01，下同。Fig.3 The difference in nutrient content between the seeds of Shanlan upland rice and conventional riceA:The total amount of amino acids in seeds;B:The difference in the contents of proline,aspartic acid,isoleucine and tyrosine in the seeds;C:The difference in the contents of glutathione in the seeds;D:The total content of unsaturated fatty acids(left) and glycerophospholipids (right) in the seeds;E:The difference in the contents of ethyl linolenate and 5-OxoETE in the seeds;F:The difference in the contents of glycerophospholipids in the seeds;G:The difference in the contents of vitamins in the seeds;H:Total content of flavonoids in the seeds;I:The ratio of C-flavonoids and O-flavonoids in seeds.*:P<0.05;**:P<0.01;similarly hereinafter.

本研究發現，山欄稻與普通水稻種子中脂類物質的積累存在顯著差異，山欄稻種子中不飽和脂肪酸的相對總含量為4×107，顯著高于普通水稻，其中，亞麻酸乙酯的相對含量是普通水稻的5.1 倍；普通水稻種子中甘油磷脂的相對總含量是山欄稻的1.4 倍，其中，1 亞油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿的相對含量是普通水稻的1.4 倍（圖3-D，圖3-E，圖3-F）；說明山欄稻種子中不飽和脂肪酸的含量顯著高于普通水稻，甘油磷脂的含量低于普通稻。比較山欄稻與普通水稻種子中維生素類物質的含量，發現山欄稻種子中大部分維生素類物質含量顯著高于普通水稻（圖3-G）。比較分析發現，普通水稻種子中黃酮類物質的相對總含量顯著高于山欄稻，是山欄稻種子中含量的1.36 倍（圖3-H）。普通水稻種子中氧黃酮（氧黃酮，糖羥基與類黃酮的羥基脫水縮合，形成 C-O糖苷鍵）和碳黃酮（碳黃酮，糖與類黃酮母核上直接脫水結合，形成C-C）的總相對含量均高于山欄稻，說明普通水稻種子中黃酮類物質含量高于山欄稻，但山欄稻種子中碳黃酮所占比例（碳黃酮相對總含量（水稻種子中檢測到的碳黃酮物質的總和）/黃酮總含量）為0.63，大于普通水稻的0.47，氧黃酮所占比例[氧黃酮相對總含量（水稻種子中檢測到的氧黃酮物質的總和）/黃酮總含量]為0.31,低于普通水稻的0.44（圖3-I)。說明山欄稻種子中碳黃酮所占比例高于普通水稻，氧黃酮所占比例低于普通水稻。

2.4 種子萌發過程中營養品質相關代謝物變化規律圖4 展示了山欄稻種子萌發過程中部分代謝物的含量變化趨勢。通過比較分析發現，在種子萌發初期，山欄稻與普通水稻中脯氨酸的相對含量相近，無明顯差異；在24～48 h 階段脯氨酸的相對含量達到1.05×109，遠高于普通水稻；隨后山欄稻種子中脯氨酸的積累速率下降，但脯氨酸的相對含量依然顯著高于普通水稻（圖4-A）。蔡能等[13]研究發現，植物體內游離脯氨酸含量越高抗逆能力越強，說明山欄稻種子萌發過程中的抗逆能力強于普通水稻。在種子萌發過程中亞麻酸乙酯也存在類似的積累模式，在萌發初期山欄稻種子中的亞麻酸乙酯含量低于普通水稻；在24～48 h 階段山欄稻種子中的亞麻酸乙酯快速積累；48 h 時，其相對含量達到最高，為2.81×107，是普通水稻的4.66 倍，然后其含量迅速下降（圖4-B）。泛酸在種子萌發過程中的積累模式與亞麻酸乙酯類似均是先升高后降低，但在山欄稻萌發過程中泛酸含量始終顯著高于普通水稻（圖4-C）。在種子萌發過程中山欄稻種子中吡哆醇的積累模式與上述代謝物的積累存在明顯差異。在山欄稻萌發過程中吡哆醇含量持續下降，在萌發初期山欄稻種子中吡哆醇的相對含量顯著高于普通水稻；在24～48 h 階段山欄稻種子中的吡哆醇含量迅速下降，在48 h 吡哆醇的相對含量僅為普通水稻中的1.28 倍；后期吡哆醇的含量緩慢下降，但總體含量依然顯著高于普通水稻（圖4-D）。

圖4 種子萌發過程中4 種代謝物的含量變化A：脯氨酸在種子萌發過程中的含量變化；B：亞麻酸乙酯在萌發過程中的含量變化；C、D：種子萌發過程中泛酸和吡哆醇的含量變化。Fig.4 Changes in the content of metabolites during seed germinationA:Changes in the content of proline during seed germination;B:Changes in the content of ethyl linolenate during germination;C,D:Changes in the contents of pantothenic acid and pyridoxine during seed germination.

3 討論

山欄稻是海南地區特有的旱稻種質資源，但關于山欄稻種子代謝組學的研究還存在許多未知。本研究利用超高效液相色譜高分辨質譜聯用技術，成功構建了山欄稻種子代謝數據庫。通過比較山欄稻與普通水稻種子間的代謝差異，發現山欄稻與普通水稻間代謝物的積累存在差異，導致代謝差異的主要原因可能是遺傳基礎。在研究水稻進化和自然變異過程中，發現不同亞種間遺傳信息的差異，導致代謝物的積累存在差異[14-15]。袁楠楠等[16]研究發現，山欄稻是不屬于普通野生稻的栽培農家種，說明山欄稻具有獨特的遺傳基礎。因此，導致山欄稻與普通水稻代謝差異的根本原因是遺傳基礎的差異。

本研究發現，山欄稻種子中谷胱甘肽、亞麻酸乙酯、泛酸和吡哆醇的含量均顯著高于普通水稻，導致代謝差異的原因可能是栽培方式的不同。山欄稻主要以旱作栽培為主，普通水稻主要以水作栽培為主；與普通水稻相比山欄稻的生長環境更復雜，容易發生干旱、高溫、冷害等非生物脅迫[17-18]。生長環境的不同，會導致植物體內代謝物的積累和合成途徑發生改變。水稻在干旱、冷害等脅迫條件處理下，體內的谷胱甘肽、脂肪酸、吡哆醇含量會增加[19]。因此，栽培方式也會影響植物體內代謝物的積累。本研究發現，山欄稻種子中碳黃酮所占比例高于普通水稻，氧黃酮所占比例低于普通稻。研究發現，氧黃酮可以預防苗期根腐病，碳黃酮可以預防病蟲害[20-21]。因為碳黃酮和氧黃酮生理功能的差異，所以栽培方式是引起山欄稻與普通水稻種子中黃酮比例差異的主要原因。

本研究發現，在種子萌發過程中，山欄稻種子中吡哆醇的含量逐漸下降，普通水稻種子中吡哆醇的含量逐漸升高。在種子萌發過程中，吡哆醇參與調節種子胚根的形成[22]。非生物脅迫條件下，也會影響植株的正常發育，從而導致生長周期的改變[23]。說明引起山欄稻和普通水稻萌發過程中代謝物積累差異的原因是種子萌發機理的不同。本研究構建的山欄稻種子代謝數據庫，能為深入研究山欄稻種子營養品質提供依據。