促生菌對煙草生長及土壤微生物數量及養分的影響

伍德洋，張再剛，彭文勇，陳 凡，鄭福端，廖 萍，陳 強，趙 珂

(1.四川省煙草公司涼山州公司鹽源分公司，四川 西昌 615200；2.四川省煙草公司涼山州公司會東分公司，四川 西昌 615200；3.四川農業大學，成都 611130)

四川省是我國3大煙葉生產基地之一，四川烤煙生產主要分布在涼山、攀枝花、瀘州、宜賓和廣元五大煙區。其中，涼山州煙區地處川西南橫斷山系東北緣，具備得天獨厚的自然條件，生產的煙葉氣味清香獨特，2017年涼山州種植煙葉6.25萬hm2，是中式卷煙的重要原料供應地，因此穩定和提高烤煙質量是涼山煙區的主要任務[1]。施肥是提高煙葉產量和質量的重要措施，而一味追求高經濟效益和產量，不合理使用化肥，且過量施肥會導致煙葉貪青晚熟，較難把握烘烤環節，容易生產出失去經濟價值的劣等煙，有效產量不高以及對壤質量和環境造成難以恢復的破壞[2]。

以微生物菌劑為代表的微生物肥料是實現“減肥減藥”“化肥零增長”“農業可持續發展”和“生態農業”不可或缺的一類低能耗、環境友好型肥料，而優良的菌種資源是研發微生物菌劑的重要來源[3-4]。放線菌是一類數量大、種類多、具有重要實用價值和開發潛力的微生物資源。放線菌通過產生抗生素、植物生長調節素等機制促進植物生長，通過產生幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶、磷酸酶等活性酶提高植物的抗逆性，是篩選功能微生物菌劑的一個重要來源[5-6]。近年來，已報道與煙草有關的促生菌主要是芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)等[7-9]；但關于放線菌促進煙草生長方面的研究鮮有報道。因此，基于本實驗室前期從篩選獲得的具有產IAA、溶磷、產鐵載體以及抑菌功能的放線菌帚狀鏈霉菌(Streptomycesscopiformis)CL21和加利福尼亞鏈霉菌(Streptomycescalifornicus)CL52為研究對象，并充分考慮兩株菌的互作作用，通過盆栽實驗研究這兩株促生菌對煙草生長的作用及其對煙草根際土壤營養和微生物數量的影響，為植煙區煙草生產可持續發展提供優良的促生菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

1.1.1 實驗場地 試驗于2019年3～5月在涼山州煙草公司會東縣分公司的育苗基地進行，采用盆栽的方式種植。

1.1.2 供試土壤 盆栽土壤采自會東縣參魚河鎮植煙大田0～20cm土壤，陰干滅菌后過2mm篩網，按7.5kg/盆裝入口徑為30cm的花盆中。

1.1.3 供試菌株 帚狀鏈霉菌(Streptomycesscopiformis)CL21，加利福尼亞鏈霉菌(Streptomycescalifornicus)CL52。

1.1.4 供試煙草材料 云煙85。

1.1.5 儀器設備 采用CIRAS-1型光合作用測定系統(英國PP-System公司)測定葉片的光合作用參數；采用EPSON1680根系掃描儀(Epson，LongBeach，USA)掃描根系進行掃描和分析。

1.2 方法

1.2.1 促生菌菌劑的制備 在三角瓶中裝入1/3量的麥粒于121℃滅菌30min冷卻至室溫。將供試菌株CL21、CL52在高氏一號培養基上活化，待菌株長滿斜面后，加入無菌水洗下孢子，再轉入裝有麥粒的三角瓶中與麥粒充分混勻，于28℃培養1周以上，待麥粒長滿白色的孢子后備用。

1.2.2 接菌與培養 煙草采用漂浮盤方法進行育苗，待長出3～5片真葉后移栽到花盆中，每個花盆中栽1株。按照不同處理給煙草灌根，3個處理加1個對照，每個處理3次重復(表1)。

1.2.3 樣品采集 待煙草生長至旺長期(50～60d)，鏟去1cm表層土，小心將煙草植株拔出，收集根際土和非根際土，洗凈植物，備用。

1.2.4 煙草農藝性狀測定 在煙草旺長期測定包括煙株株高、莖圍、有效葉片數、最大葉長、最大葉寬、植株地上地下部的鮮重和干重等數據。

1.2.5 煙草光合作用 待煙草長至旺長期，參照肖雨等人[10]的方法采測定煙葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、細胞間隙CO2濃度(Ci)等指標。

1.2.6 煙草根系形態研究 參加李靜等人的方法對各組樣品的根系總長度、總根表面積、總根體積和總根毛數等形態指標[11]。

1.2.7 煙草及其土壤養分含量測定 參考鮑士旦等人[12]方法測定測定煙草全氮、全磷、全鉀，土壤全氮、全磷、全鉀，速效氮、速效磷、速效鉀含量以及有機質含量。

1.2.8 煙草及土壤微生物數量測定 參考沈萍等人[13]方法分離煙草根、莖、葉以及根際和非根際土壤中的細菌、放線菌和真菌，并測定各類菌的數量。

1.2.9 數據分析 Excel采用SPSS20.0軟件進行方差分析和LSD法多重比較。

2 結果

2.1 接種菌株對煙草全氮、全磷、全鉀含量的影響

盆栽實驗表明，接種菌劑后對煙草根、莖、葉中全氮、全磷和全鉀的具有較大影響。混合菌劑CL21+CL52處理后的煙草根、莖、葉中的全氮的含量顯著高于單菌處理，且均遠高于對照組，但單菌CL21和CL52處理之間，以及單菌處理與對照組全氮含量差異都不明顯。煙草全鉀、全磷的分析結果表明，經過接種菌劑處理后，煙草的根、莖、葉中全鉀和全磷含量均高于對照組，混合菌劑CL21+CL52處理的效果明顯高于單菌處理，煙草經CL21+CL52處理煙莖中的全磷含量經提高了1.6%，煙葉的全鉀含量提高了1.5%。結果表明，促生菌CL21和CL52能提高煙草植株內全氮、全磷、全鉀的含量，且混合菌劑CL21+CL52效果更佳。

2.2 促生菌對煙草根際土與非根際土養分含量影響

通過對接種單菌CL21、CL52、混合菌劑CL21+CL52以及不接種促生菌劑煙草根際土與非根際土壤理化成分的分析發現，接種促生菌劑后的煙草根際土壤與對照組之間存在顯著性差異(P<0.05)。接種菌劑后根際土壤分析結果表明，除單菌CL52處理根際土中有效鉀較CK組低外，煙草根際土壤壤中的堿解氮、速效鉀、有效磷和有機質在接種促生菌劑后均有顯著增加，表現為混菌CL21+CL52>單菌CL52>單菌CL21>CK；接種菌劑后非根際土壤分析結果表明，混菌CL21+CL52處理后土壤中的堿解氮、速效鉀、有效磷和有機質顯著高于單菌CL21、CL52處理以及對照組處理，單菌處理與對照組無明顯差異，其中單菌處理的有效鉀和有機質還顯著低于對照組(表2)。

表2 促生菌對土壤理化性質的影響

2.3 促生菌對煙草生長的影響

盆栽結果表明，接種菌劑后能較好的促進煙草的生長。煙草生長數據統計結果表明，混菌CL21+CL52處理在煙草株高、最大莖圍、最大葉長和最大葉寬均優于其它處理，較對照組分別增加35.5%，28.5%，25.5%，15.2%，較單菌CL21處理分別增加了25.8%，11.4%，12.5%，4.5%，較單菌CL52處理分別增加了29.1%10.3%7.1%3.2%，單菌CL21和CL52處理優于對照組。

煙草地上和地下2個部分的鮮重和干重也均是混菌CL21+CL52處理效果最佳，較對照組煙草鮮重和干重分別增加了47.2%，27.6%，45.7%，21.8%。除單菌CL52地下部的鮮重和干重低于對照組外，單菌處理組均能促進煙草地下部分的生長。煙草有效葉片數統計結果表明，各處理組煙草有效葉片數CL21+CL52(17片)>CL21(13片)>CL52(12片)>CK(10片)。

2.4 煙草光合作用分析

對煙草凈光合速率的測定結果表明，各處理的凈光合速率為CL21+CL52(10.58)>CL52(9.88)>CL21(9.67)>CK(8.99)，混菌CL21+CL52處理下煙草葉片凈光合速率最大，表明其光能利用率最高；單菌處理凈光合速率均大于對照組，表明接種促生菌劑能有效提高煙草葉片的光能利用率(表3)。

經測定，煙草的氣孔導度為混合菌劑CL21+CL52(1.12)>CL21(0.85)>CL52(0.58)>CK(0.50)，混菌處理CL21+CL52組處理的氣孔導度最大，而對照組處理的氣孔導度最小，說明該組處理下的煙草葉片生理活性最強(表3)。

對各處理煙草胞間CO2濃度和蒸騰速率的分析結果表明，胞間CO2濃度為CL21+CL52(372.56)>CL21(353.45)>CL52(342.65)>CK(332.32)；單菌CL21和CL52的蒸騰速率無差異，混菌CL21+CL52蒸騰速率明顯高于其它處理，進一步表明促生菌CL21和CL52能提高煙草的生理活性強度和光能利用率，促進煙草的生長(表3)。

表3 煙草光合作用測定結果

2.5 煙草根系形態研究

各處理煙草旺長期的根系形態經過根系掃描結果表明，顯示樣品間存在顯著性差異(P<0.05)，接菌劑處理的各項指標均大于對照組，且CL21+CL52處理下根的總根長、總表面積、平均直徑、總體積和總根毛數均最大，分別為9678.12cm，1296.76cm2、1.99mm、14.98cm3、13867.67個(表4)。

表4 煙草根系形態特征

2.6 促生菌對煙草及土壤中微生物數量的影響

本研究對接種菌劑后煙草的根、莖及其根標土壤、非根際土壤中的微生物數量進行計數分析。結果表明，接種菌劑影響了煙草和土壤中三大微生物的數量分布，接種混菌CL21+CL52對煙草根、莖、葉中細菌數量影響最大，對土壤中細菌的數量影響不明顯；接種混菌CL21+CL52后煙草根中放線菌的數量明顯高于單菌處理和對照組，而接種單菌CL52對煙草莖中放線菌的數量影響較大，但接種菌劑對煙草葉及其根際和非根際中放線菌數量無明顯影響，；煙草根中真菌數量受菌劑CL52的影響較大，莖和葉中真菌數量在接種菌劑后無明顯變化，但接種混菌CL52+CL21增加了根際和非際土壤真菌數量(表5)。

表5 促生菌對煙草各部位及其土壤微生物數量的影響

3 討論

氮、磷、鉀是植物生長所必需的營養元素，植物的光合作用和體內的生化過程都必須有它們的參與，植物中全氮、磷、鉀的含量可以揭示植物的營養狀態，以及吸收利用氮、磷、鉀的能力[13-14]。煙草全氮、磷、鉀測定結果表明，接種菌劑CL21、CL52、CL21+CL52后顯著增加了的煙草中的全氮、磷、鉀的含量，其中接種混合菌劑CL21+CL52表現出的效果最佳。煙草根際土與非根際土中堿解氮、速效鉀、有效磷和有機質含量測定值表明接種菌劑的各處理均優于對照處理，這可能是促生菌株CL21、CL52分離自植物內部，能很好的在植物體內定殖并通過其生長繁殖、產生次級代謝產物提升煙草活力，增加其對各營養元素的吸收，同時通過刺激根系分泌物的產生增加了根際土和非根際土中氮、磷、鉀及有機質的含量。本研究結果表明接種促生菌CL21和CL52能夠提高植煙土壤氮、磷、鉀、有機質含量以及提升煙草對氮、磷、鉀的吸收利用水平，有利改善土壤肥力狀況，為煙草的正常生長發育營造良好的土壤環境[15-16]。

接種促生菌劑后煙草植株的株高、最大莖圍、最大葉長、最大葉寬、干重、鮮重、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均增加，根株的總根長、總表面積、平均直徑、總根體積、總根毛數較其它處理有顯著性差異，說明接種促生菌后能夠調節煙草氣孔導度，提高胞間CO2濃度、蒸騰速率與凈光合速率，促進根系生長，從而提高煙草的生物量。值得注意的是，相較于單株處理繃帶，混菌CL21+CL52處理對煙草營養的吸收、煙草生物量以及根際土壤肥力水平的提升更為有效。已有的研究表明，在實際生產應用中，相較于單一菌株，采用多種優勢菌株進行混合后接種到植株上，具有更好的接種效益[17]，這是因為多種混合菌之間通過協同作用，能完成一些單一菌株無法完成的較為復雜的生理生化反應[18-19]。

此外，煙草及其根際土和非根際土中微生物數量測定的結果顯示，接種促生菌CL21、CL52后增加了煙草的根、莖、葉和根際土中細菌數量增加，非根際土的細菌數量減少；煙草的根、莖、葉、根際土和非根際土中放線菌的數量增加；煙草根、莖、根際土和非根際土的真菌增加，煙草葉中真菌數量減少，說明放線菌能夠豐富煙草及其根際土中微生物的群落結構，非根際土中的細菌和煙草葉中真菌數量減少的原因可能是放線菌對其應菌群有競爭作用，而根灌的菌株在數量上占有優勢從而導致相應環境中細菌和真菌數量的減少，表明接種促生菌后對煙株根際土壤的微生物區系產生了影響，這種變化可對提高煙株根際土壤的生態功能有積極作用[20]。

4 結論

促生菌CL21、CL52通過活化土壤營養元素，提高煙草營養元素吸收水平，促進根系生長、提高煙草光合效率，改變煙草內部及其土壤中微生物群落的方式促進煙草生長，為煙草專用微生物菌劑的研發提供了優良菌株資源。