基于核基因RAG1海蛇分子系統學初步研究

王湘君 陳 文 蘇海英

①海南熱帶海洋學院水產與生命學院，兩棲爬行動物研究省級重點實驗室②南京師范大學生命科學學院 ③海南熱帶海洋學院海洋科學技術學院

國內兩棲爬行動物分子系統學研究，通常采用線粒體基因片段。目的：為研究核基因片段在海蛇分子系統學中的可行性。方法：搜索并下載NCBI上所有海蛇RAG1基因序列。運用Mega軟件比對后，建立MrBayes系統聚類樹。結果：結果顯示，數據庫中共包括2亞科6屬41種的RAG1序列，系統發育樹支持率不高，部分分支不清晰；中國產的5個單屬單種都應隸屬于真海蛇屬，海蛇的親緣關系與地域關系不明顯。結論：建議RAG1基因與線粒體基因聯合建樹，并更新《中國動物志》。

1 前言

海蛇肉營養蛋白高、滋味鮮美、食之強身健體。鮮食或加工罐頭食品均可，經濟價值很高。

海蛇亞科Hydrophiinae和扁尾海蛇亞科Laticaudinae，與眼鏡蛇亞科Elapinae相似，具有前溝牙的毒蛇。尾側扁如槳，軀干后部亦略側扁[1]。

多數海蛇聚集在北大洋洲和南亞半島之間，比如環紋海蛇、長吻海蛇、青環海蛇和青灰海蛇等幾種海蛇發現于溫帶水域。

中國沿海分布著長吻海蛇、黑頭海蛇、平頦海蛇、扁尾海蛇、環紋海蛇、半環扁尾海蛇、青環海蛇、淡灰海蛇、青灰海蛇、小頭海蛇、棘眥海蛇、海蝰、藍灰扁尾海蛇、龜頭海蛇、棘鱗海蛇等l5種扁尾海蛇亞科和海蛇亞科。這些海蛇主要生存南海、北部灣以及瓊、臺、粵、桂和閩等沿海區域，長吻海蛇分布于中國沿海省份[2]。

通過 DNA 分子標記技術研究蛇類親緣關系和進化地位，對蛇類資源的科學評估和保護及開發利用都有重要意義[3-5]，但國內都是基于線粒體基因的進化樹分析。

重組激活蛋白基因（recombination activating gene，RAG）是脊椎動物內特有的一類基因，在脊椎動物T細胞受體和免疫血球素基因的重排與重組過程中扮演著關鍵角色[6]。RAGs，尤其是RAG1，具有進化緩慢，第3位密碼子變化最小，不同物種之間的堿基組成近乎恒定等一些適于用來研究系統發育的特點[7]。

該基因作為脊椎動物特異性免疫反應的關鍵基因，國內已經應用于魚類[8-11]和鳥類[12]多個物種 DNA 水平上的序列分析。國外也成功運用于兩棲類[13]和爬行類[14]的分子系統樹的建立。

本實驗研究旨在通過比較分析2亞科6屬41種的 RAG1 序列，構建分子系統進化樹，探討該基因建樹的可行性，并初步分析海蛇的系統關系。

2 材料與方法

研究材料及方法如下所示。

從NCBI搜索所有海蛇RAG1基因序列，若某個物種的序列多于5條，則最多保留5條，根據序列號，盡量保留不同來源的數據，共下載海蛇亞科和扁尾海蛇亞科6屬41種78條序列。

表1 從GenBank下載的RAG1序列旋海蛇

下載序列存為fasta文件并輔以手動校正，進而序列放進MEGA7.0進行校對。通過基因序列數據處理后應用Java（Sequence Matrix）構建的貝葉斯系統樹，采用標準模型，300萬代收斂，約6h收存。

同樣的模型，換用計算服務器平臺由重慶有線電視網絡股份有限公司提供云計算環境，36VCPU，32G內存，13min完成收樹。

3 結果與分析

如圖，海蛇亞科（Hdrophiinae）6屬41個物種，多物種混為一支，扁尾海蛇亞科（Laticaudinae）)同種個體聚集趨勢明顯，同物種除海蛇屬相應分支支持率均低于40%。整體樹總體拓撲結構不清晰。有個別不清晰點為物種名有變動，此樹建樹時間過長且多物種混為一支無法應用。

物種名有變動點：Polyodontognathuscaerulescens現用名Hydrophiscaerulescens、Microcephalophisgracilis現用名Hydrophisgracilis、Leioselasma elegans現用名Hydrophis elegans。

圖1 RAG1貝葉斯系統聚類樹

3.1 扁尾海蛇屬

從樹上可以看出，扁尾海蛇屬（Laticauda）并未聚為一支。其中，扁尾海蛇（L.laticaudata）和額扁尾海蛇（L.frontalis）親緣關系非常近，兩者與外群眼鏡蛇（Najanaja）聚為一支，處于系統發育樹的根部。而藍灰扁尾海蛇（L.Colubrina）形成時間略晚，在劍尾海蛇屬大支之后，其它海蛇之前。此分支點的支持率高達99%。

3.2 真海蛇屬

絕大多數真海蛇聚為一個大支。其中斯里蘭卡海蛇（Hydrophislapemoides）和細頸海蛇（H.coggeri）聚成的小支分化時間相對最早。其它真海蛇形成11個分支。

第一分支中，小頭海蛇（H.gracilis）和青灰海蛇（H.Caerulescens）親緣關系最近，再與印度洋平頦海蛇（H.curtus）聚為一小支。青環海蛇（H.cyanocinctus）位于另一小支。均為中國海域發現的物種，除青灰海蛇外，都曾發現于南海海域。

第二分支中，印度洋平頦海蛇（H.curtus）和棘眥海蛇（H.peronii）交錯聚成一小支，印度洋平頦海蛇明顯不呈單系。另一小支中，螺旋海蛇（H.spiralis）鑲嵌于裂頦海蛇（H.schistosus）之中，再與南越海蛇（H.parviceps）匯聚。

第三分支中，另一條螺旋海蛇（H.spiralis）和白氏海蛇（H.belcheri）親緣關系最近，再與棘鱗海蛇（H.stokesii ）匯聚，但棘鱗海蛇不呈單系。

第四分支中，孟加拉海蛇（H.stricticollis）和黑尾海蛇（H.viperinus）親緣關系最近，再與印澳海蛇（H.elegans）匯聚，金氏海蛇（H.kingii）相對最原始。

第五分支中，大海蛇（H.major）和細頸海蛇（H.coggeri）親緣關系近，太平洋海蛇（H.pacificus）和淡灰海蛇（H.ornatus）親緣關系近。

第六分支中包括：沙撈越海蛇（H.brooki）、麥氏海蛇（H.macdowelli）、截吻海蛇（H.jerdonii）。但麥氏海蛇不呈單系。

第七分支中，青環海蛇（H.cyanocinctus）相對最原始。麥氏海蛇（H.macdowelli）鑲嵌于長吻海蛇（H.platurus）之中，兩者與另一條淡灰海蛇（H.ornatus）匯聚，再與松達斑海蛇（H.obscurus）匯聚成一個小支。而黑頭環紋海蛇（H.atriceps）和另一條青環海蛇（H.cyanocinctus）匯聚于另一小支。

第八分支中，淡灰海蛇（H.ornatus）與厚尾海蛇（H.pachycercos）親緣關系近，松達斑海蛇（H.obscurus）麥氏海蛇（H.macdowelli）親緣關系近。

第九分支僅包括一條太平洋海蛇（H.pacificus）和一條斯里蘭卡海蛇（H.lapemoides）。

第十分支中，一條長吻海蛇（H.platurus）和一條太平洋海蛇（H.pacificus）鑲嵌于茲韋費爾海蛇（H.zweifeli）之中，茲韋費爾海蛇不呈單系。

第十一分支中，環紋海蛇（H.fasciatus）和黑頭環紋海蛇（H.atriceps）親緣關系近，再與茲韋費爾海蛇（H.zweifeli）和太平洋海蛇（H.pacificus）聚為一小支；另一小支包括一條斯里蘭卡海蛇（H.lapemoides）和一條細頸海蛇（H.coggeri）。

3.3 其它海蛇

劍尾海蛇屬大支明顯形成兩個分支。其中，劍尾海蛇屬（Aipysurus）和龜頭海蛇屬（Emydocephalus）聚為一支。但龜頭海蛇（E.annulatus）嵌于多種劍尾海蛇之中，劍尾海蛇屬未成單系。

杜氏劍尾海蛇（A.duboisii）和短鼻劍尾海蛇（A.apraefrontalis）親緣關系很近；龜頭海蛇（E.annulatus）與欖綠劍尾海蛇（A.laevis）親緣關系很近，龜頭海蛇鑲嵌于三條欖綠劍尾海蛇之中。以上四種蛇聚為一小支。

而尖尾海蛇（A.eydouxii）和灰刺尾海蛇（A.fuscus）親緣關系很近，聚為另一小支。真海蛇屬中的唐納德海蛇（Hydrophisdonaldi）也鑲嵌其中。

在劍尾海蛇屬大支的另一分支中，包括兩個單屬單種，即達爾文海蛇（Hydrelapsdarwiniensis）和異海蝰（Parahydrophismertoni）。

4 討論

4.1 分支問題

細頸海蛇（H.coggeri）、印度洋平頦海蛇（H.curtus）、棘鱗海蛇（H.stokesii ）、麥氏海蛇（H.macdowelli）、長吻海蛇（H.platurus）、淡灰海蛇（H.ornatus）、青環海蛇（H.cyanocinctus）、松達斑海蛇（H.obscurus）、太平洋海蛇（H.pacificus）、斯里蘭卡海蛇（H.lapemoides）、茲韋費爾海蛇（H.zweifeli）、黑頭環紋海蛇（H.atriceps）和欖綠劍尾海蛇（A.laevis），共13個物種不呈單系。

運用細胞核基因RAG1基因建樹，約1/3的多條序列的蛇類，同一物種并未聚為一支，與線粒體基因建樹研究結果相似，但其有爭議的物種數比例明顯高于線粒體基因[15]。

許多分支支持率并不高，且并未形成二岔分化。可見核基因單獨使用，聚類效果不清晰。但考慮到海蛇研究起步晚，物種鑒定尚不成熟，作者暫時建議，核基因建樹需要聯合線粒體基因，以提高支持率。

4.2 分類問題

從系統樹上可以看出，《中國動物志》上記載的5個單屬單種，棘眥海蛇（Acalyptophisperonii）、棘鱗海蛇（Astrotiastokesii）、截吻海蛇（Keriliajerdonii）、長吻海蛇（Pelamis platurus）和海蝰（Praescutataviperina），都鑲嵌于真海蛇屬（Hydrophis）大支之中。這與全球海蛇分布最多的國家澳大利亞的研究一致[16]。作者建議，中國需要重新修訂工具書《動物志》，某些屬、種的命名應參考國際國內最新的研究成果。

由圖可知，斯里蘭卡海蛇和細頸海蛇、小頭海蛇和青灰海蛇、印度洋平頦海蛇和棘眥海蛇、裂頦海蛇和南越海蛇、白氏海蛇與棘鱗海蛇、孟加拉海蛇和黑尾海蛇、印澳海蛇和金氏海蛇、沙撈越海蛇和截吻海蛇、淡灰海蛇與厚尾海蛇，以及杜氏劍尾海蛇和短鼻劍尾海蛇、尖尾海蛇和灰刺尾海蛇、額扁尾海蛇和扁尾海蛇，都有著較近的親緣關系。

4.3 分布問題

同屬蛇類的親緣關系遠近，往往與地域遠近相關[17,18]。但海蛇的地域遷徙路線阻礙相對較少，其活動范圍普遍大于陸地蛇類。從系統樹上可以看出，真海蛇屬除第一分支的蛇類在中國海域均有分布；除第第九分支外，其余9個分支，都有1-2和物種在中國海域有記載。

而中國南海海域所產的8個物種中，除黑頭海蛇（H.melanocephalus）外，其余7個物種的RAG1基因在NCBI上均有序列。長吻海蛇（H.platurus）位于第七、第十分支，平頦海蛇（H.curtus）位于第一、第二分支；青灰海蛇（H.caerulescens）位于第一分支，青環海蛇（H.cyanocinctus）位于第一、第七分支，環紋海蛇（H.fasciatus）位于第七、第十一分支，小頭海蛇（H.gracilis）位于第一分支，淡灰海蛇（H.Ornatus）位于第五、第七、第八分支。可見，即使同屬，南海的海蛇在系統樹上并未聚集。

5 結論

RAG1基因在NCBI上包括的物種多，可以運用于分子系統學建樹，但建議與線粒體基因聯合建樹。

本研究與國際研究一致，5個單屬單種（棘眥海蛇、棘鱗海蛇、截吻海蛇、長吻海蛇和海蝰）的分類地位應重新界定，建議更新《中國動物志》。

據目前的研究來看，同屬海蛇的分布區域，與親緣關系的遠近，沒有明顯的相關性。